Μελέτη της βιολογικής λειτουργίας επιλεγμένων πρωτεϊνών του ιού της ηπατίτιδας C

Abstract

Hepatitis C is a major public health problem worldwide, and a major cause of chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. HCV is a single stranded, positive-sense RNA virus that belongs to the family Flaviviridae. HCV has not been definitively visualized and its structure remains to be elucidated. However, it is known that HCV circulates in various forms in the infected host. Although HCV is an enveloped virus, previous observations have suggested that nucleocapsids without a lipid envelope circulate in the serum of HCV-infected patients. However little is known about the nature, the origin and the properties of these naked particles. In addition, defective HCV genomes lacking envelope-coding sequences have recently been identified. Aside from its role in the nucleocapsid formation, HCV core has been shown to be a multifunctional protein and to affect many host cell functions, such as lipid metabolism, apoptosis, gene transcription and signaling pathways. Furthermore, core has been associated with the induction of steatosis and hepatocellular carcinoma, and may also have an immunoregulatory role. Importantly, until recently it was not possible to culture HCV efficiently in vitro. The aim of the present study was the generation of reagents for the study of the biological function of the HCV core protein, the production and purification of recombinant HCV capsids, and the elucidation of the biological significance (functional properties) of the naked capsids. Initially, we focused on the construction , preparation and characterization of reagents, to be used for the expression and study of the biological function of core. These reagents include a specific polyclonal antibody, expression plasmids, a stable inducible cell line, as well as viral vectors, based on the herpes virus and the baculovirus. Use of these reagents has permitted the efficient expression and detection of the HCV core protein in bacteria, insect and mammalian cells (both cell lines and primary culture). We next investigated, by biochemical analysis and electron microscopy, whether these expression systems (mainly the viral vectors) can support the auto-assembly of core protein, in the absence of other viral proteins. Furthermore, using the recombinant herpes virus, the effect of core in the ERK signa transduction pathway was studied. Using the baculovirus expression system, we showed that the HCV core protein is very efficiently expressed in insect cells, and that it can sufficiently direct the formation of capsid-like particles, in the absence of other HCV proteins and of the 5’ untranslated genome. These particles could be purified from cell extracts, and were characterized. Finally, we examined whether recombinant capsid-like particles, produced in insect cells, could bind and enter into cells. This is the first report showing that recombinant non-enveloped capsids are competent for binding and entry into cells of hepatic origin. Moreover, it was shown that the capsid-like particles and the antibody may enter the cells as an immune complex. Binding of naked core particles was also shown to modulate the Ras/ERK pathway.

Η ηπατίτιδα C αποτελεί παγκόσµιο πρόβληµα δηµόσιας υγείας. Η λοίµωξη από τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) αποτελεί κύρια αιτία χρόνιας ηπατίτιδας, κίρρωσης του ήπατος και ηπατοκυτταρικού καρκινώµατος. Ο HCV ανήκει στην οικογένεια Flaviviridae. Το γονιδίωµα του ιού είναι ένα µονόκλωνο µόριο RNA θετικής πολικότητας. Το ιικό σωµατίδιο δεν έχει ακόµη παρατηρηθεί οριστικά στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο, και η δοµή του δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως. Εντούτοις, είναι γνωστό ότι ο ιός κυκλοφορεί σε διάφορες µορφές στον ξενιστή. Αν και πρόκειται για ιό που διαθέτει έλυτρο, έχει αναφερθεί και η ύπαρξη καψιδίων που δεν διαθέτουν φάκελο. Παρ’ όλα αυτά, πολύ λίγα είναι γνωστά για την φύση, την προέλευση και τις ιδιότητες των γυµνών αυτών καψιδίων. Πρόσφατα αναγνωρίστηκε και η ύπαρξη ελλειπτικών γονιδιωµάτων του ιού, µε ελλείψεις στην περιοχή των γλυκοπρωτεϊνών του φακέλου. Υπεύθυνη για τον σχηµατισµό του νουκλεοκαψιδίου του ιού είναι η καψιδιακή πρωτεΐνη core. Φαίνεται όµως ότι πρόκειται για µία πολυλειτουργική πρωτεΐνη, που µπορεί να επιδρά σε πολλές λειτουργίες του κυττάρου - ξενιστή, όπως τον µεταβολισµό των λιπιδίων, την απόπτωση, την µεταγραφή γονιδίων και την µεταγωγή σήµατος. Επιπλέον, η πρωτεΐνη έχει συσχετισθεί µε την επαγωγή στεάτωσης και ηπατοκυτταρικού καρκίνου, και µπορεί να έχει και ανοσορρυθµιστικό ρόλο. Μέχρι πρόσφατα, δεν υπήρχε διαθέσιµο σύστηµα κυτταροκαλλιέργειας για τον αποτελεσµατικό πολλαπλασιασµό του ιού in vitro. Στόχος της παρούσης µελέτης υπήρξε η ανάπτυξη αντιδραστηρίων για τη µελέτη της βιολογικής λειτουργίας της καψιδιακής πρωτεΐνης του HCV, η παραγωγή και η αποµόνωση ανασυνδυασµένων καψιδίων του ιού, καθώς και η διερεύνηση της βιολογικής σηµασίας των γυµνών καψιδίων. Αρχικά το ενδιαφέρον µας επικεντρώθηκε στην κατασκευή, την ανάπτυξη και τον χαρακτηρισµό αντιδραστηρίων για την έκφραση και τη µελέτη της βιολογικής λειτουργίας της πρωτεΐνης core. Τα αντιδραστήρια αυτά περιλαµβάνουν ειδικό πολυκλωνικό αντίσωµα, πλασµιδιακούς φορείς έκφρασης, σταθερή επαγόµενη κυτταρική σειρά, που βασίζεται στο σύστηµα της εκδυσόνης, καθώς και ιικούς φορείς, που βασίζονται στον ιό του απλού έρπητα και τον βακουλοϊό. Τα αντιδραστήρια αυτά επέτρεψαν την αποτελεσµατική έκφραση και ανίχνευση της καψιδιακής πρωτεΐνης του HCV σε κύτταρα βακτηρίων, εντόµων και κυττάρων θηλαστικών (κυτταρικών σειρών, καθώς και κυττάρων πρωτογενούς καλλιέργειας). Ακολούθησε η διερεύνηση, µε βιοχηµικές µεθόδους και ηλεκτρονική µικροσκοπία, της δυνατότητας των συστηµάτων αυτών (κυρίως των ιικών φορέων) να υποστηρίξουν την αυτοσυγκρότηση της καψιδιακής πρωτεΐνης, απουσία των άλλων πρωτεϊνών του ιού. Επιπλέον, µε την χρήση του ανασυνδυασµένου ερπητοϊού, µελετήθηκε η επίδραση της core στο µονοπάτι µεταγωγής σήµατος των ERK κινασών. Ειδικά για το σύστηµα των ανασυνδυασµένων βακουλοϊών, δείχθηκε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης είναι πολύ αποτελεσµατική στα κύτταρα εντόµων, και ότι επαρκεί, απουσία των υπόλοιπων ιικών πρωτεϊνών και της 5΄ µη µεταφραζόµενης περιοχής, για τον σχηµατισµό ανασυνδυασµένων καψιδίων, που αποµονώθηκαν από τα κυτταρικά εκχυλίσµατα και χαρακτηρίσθηκαν. Τέλος, διερευνήθηκε εάν τα ανασυνδασµένα καψίδια, που παρήχθησαν σε κύτταρα εντόµων µε τον ανασυνδυασµένο βακουλοϊό, µπορούν να προσδεθούν και να προσληφθούν από ηπατικά κύτταρα. Η παρούσα µελέτη αποτελεί την πρώτη αναφορά σχετικά µε την ιδιότητα των ανσυνδυασµένων γυµνών HCV καψιδίων να προσδένονται και να εισέρχονται σε κύτταρα ηπατικής προέλευσης. ∆είχθηκε επίσης ότι τα ανασυνδυασμένα καψίδια μπορούν να μπαίνουν στα κύτταρα ως ανοσοσύμπλεγμα με το ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα. Επιπροσθέτως, δείχθηκε ότι η πρόσδεση των γυμνών καψιδίων στα κύτταρα μπορεί να επιδράσει στο μονοπάτι Ras/ERK.