Διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών δράσης του επαγόμενου από την υποξία μεταγραφικού παράγοντα ΗΙF-2α

Abstract

Hypoxia-Inducible Factor 2 (HIF-2) is a major component of the cellular response to oxygen deprivation. HIF-2 is a transcriptional activator composed of a hypoxia-inducible alpha subunit (HIF-α) and a stably expressed beta subunit HIF-1β (ARNT). Apart from oxygen, HIF-2α subunit is also controlled by oxygen-independent mechanisms that include its post-translational modification such as phosphorylation. Although HIF-2 function was correlated with ERK1/2 pathway activation, there were no data to support its direct phosphorylation by ERKs and the underlying molecular mechanism.In the first part of this thesis, we investigated the phosphorylation of HIF-2α by ERK1/2 under hypoxia. We demonstrate that HIF-2α is phosphorylated at serine residue 672. Obstruction of this phosphorylation decreases HIF-2 transcriptional activity by mislocalizing HIF-2α to the cytoplasm without affecting HIF-2α protein expression levels. Furthermore, we demonstrate that both HIF-2α nuclear accumulation and transcriptional activity is re-established by inhibiting nuclear protein export upon addition of the exportin CRM1 inhibitor, Leptomycin B. Immunofluorescent microscopy, reporter gene and immunoprecipitation experiments further demonstrate that HIF-2α associates with the exportin CRM1 in a phosphorylation-sensitive manner and identify two critical Leucine residues as part of an atypical CRM1-dependent nuclear export signal (NES) that neighbours Ser672. CRM1 inhibition or mutation of these Leu residues restores the nuclear accumulation and activity of HIF-2α that lacks the ERK1/2 modification site. In summary, we reveal a novel regulatory mechanism of HIF-2 that involves the ERK1/2-dependent phosphorylation of HIF- 2α, which controls HIF-2α nucleocytoplasmic shuttling and, thus, HIF-2 transcriptional activity. This regulatory crosstalk between ERK1/2 and HIF-2 described in this thesis, provides an alternative means to control HIF-2 activity in disease, which can potentially provide valuable tools and information for treating hypoxia-related diseases such as cancer.HIFs are major components of the regulatory mechanism that supports the adaptation of cancer cells to oxygen deprivation. Moreover, bibliographic data demonstrate the anti-cancer role of vitamin D. Although there are a few reports showing that the HIF-1α subunit is regulated by the bioactive metabolite of vitamin D, 1,25(OH)2 D, there are no data that correlate 1,25 (OH)2D to HIF-2α. The second aim of this thesis was the investigation of the effect of 1,25(OH)2D on both HIF-α subunits under hypoxic conditions in Huh7 cancer cells. Our results indicate that both HIF-α subunits protein levels are decreased in response to 1,25(OH)2D addition. This decrease of HIF-α protein levels is accompanied by the partial transcriptional inactivation of HIFs under hypoxia. Silencing of vitamin D3 receptor (VDR) experiments under hypoxic conditions showed that 1,25 (OH)2D affects both HIF-α protein levels and HIF transcriptional activity in a non-genomic fashion. Clarification of underlying molecular mechanisms that control the regulation of HIFs by vitamin D, could potentially contribute to the development of therapeutic interventions in cancer.

Ο επαγόμενος από την υποξία παράγοντας 2 (HIF-2) είναι βασικό συστατικό της κυτταρικής προσαρμογής στην ελάττωση της συγκέντρωσης του οξυγόνου. Ο HIF-2 είναι μεταγραφικός ενεργοποιητής αποτελούμενος από μια άλφα υπομονάδα που ρυθμίζεται από το οξυγόνο (HIF-α) και την HIF-1β υπομονάδα (ARNT) που εκφράζεται σταθερά. Αν και το οξυγόνο αποτελεί κύριο ρυθμιστή του HIF-2α, η μεταγραφική ενεργότητα του HIF-2 ελέγχεται, επίσης, από μηχανισμούς που δεν εξαρτώνται από αυτό, όπως η φωσφορυλίωση. Αν και η λειτουργία του HIF-2 είχε συσχετιστεί παλαιότερα με την ενεργοποίηση του μονοπατιού των ERK1/2, δεν υπήρχαν στοιχεία για την άμεση φωσφορυλίωση του HIF-2α από τις ERK αλλά και για τον μοριακό μηχανισμό που ελέγχει την δράση του μεταγραφικού παράγοντα.Στο πρώτο μέρος της διατριβής, διερευνήσαμε τη φωσφορυλίωση του HIF-2α από τις ERK1/2 σε συνθήκες υποξίας. Αρχικά, δείξαμε ότι ο HIF-2α φωσφορυλιώνεται στο κατάλοιπο σερίνης 672. Η κατάργηση της φωσφορυλίωσης, μειώνει τη μεταγραφική δράση του HIF-2 λόγω μετατόπισης του HIF-2α στο κυτταρόπλασμα χωρίς ταυτόχρονη αλλαγή των επιπέδων της πρωτεΐνης του HIF-2α. Επιπλέον, δείξαμε ότι τόσο η συσσώρευση του HIF-2α στον πυρήνα, όσο και η μεταγραφική ενεργότητα του HIF-2 αποκαθίστανται με αναστολή της εξαγωγής των πυρηνικών πρωτεϊνών από τον αναστολέα της εξπορτίνης CRM1, λεπτομυκίνη Β. Επιπλέον δείξαμε ότι ο HIF-2α συνδέεται με την CRM1 με τρόπο ευαίσθητο στη φωσφορυλίωση. Τέλος, ταυτοποιήσαμε δύο κρίσιμα κατάλοιπα λευκίνης που γειτνιάζουν με την θέση φωσφορυλίωσης από τις ERK ως μέρη ενός εξαρτώμενου από τη CRM1, άτυπου, σήματος πυρηνικής εξαγωγής (NES). Η κατάργηση των καταλοίπων λευκίνης, αποκαθιστά την πυρηνική συσσώρευση και τη μεταγραφική ενεργότητα του HIF-2α που δεν τροποποιείται από τις ERK1/2. Συνοπτικά, αποκαλύψαμε ένα νέο ρυθμιστικό μηχανισμό του HIF-2, που περιλαμβάνει τη φωσφορυλίωση του HIF-2α από τις ERK1/2 η οποία ελέγχει τον εντοπισμό του HIF-2α στον πυρήνα και, συνεπώς, την μεταγραφική δράση του HIF-2. Οι HIF είναι σημαντικοί ρυθμιστές της προσαρμογής των καρκινικών κυττάρων στην υποξία. Πληθώρα βιβλιογραφικών δεδομένων καταδεικνύει την αντικαρκινική δράση της βιταμίνης D. Παρότι υπάρχουν λίγες αναφορές που υποδεικνύουν ότι η HIF-1α υπομονάδα ρυθμίζεται από τον βιοενεργό μεταβολίτη της βιταμίνης D, 1,25(OH)2D, δεν υπάρχουν στοιχεία που να συνδέουν τη δράση της 1,25(OH)2D με τον HIF-2α. Δεύτερος στόχος της διατριβής ήταν η συγκριτική μελέτη της δράσης της 1,25(OH)2D στη ρύθμιση των HIF-α υπομονάδων σε καρκινικά κύτταρα, Huh7. Δείξαμε ότι παρουσία της 1,25(OH)2D μειώνονται τα πρωτεϊνικά επίπεδα των HIF-α και η μεταγραφική δράση των HIF σε συνθήκες υποξίας. Πειράματα αποσιώπησης του υποδοχέα της βιταμίνης D3 (VDR) σε συνθήκες υποξίας έδειξαν ότι η μείωση των πρωτεϊνικών επιπέδων των HIF-α και της μεταγραφικής δράσης των HIF διαμεσολαβείται από κάποιον μηχανισμό που είναι ανεξάρτητος της γενωμικής δράσης της 1,25(OH)2D. Περαιτέρω αποσαφήνιση του ρυθμιστικού μηχανισμού δράσης της 1,25(OH)2D στην ενεργότητα των HIF θα μπορούσε δυνητικά να συμβάλει σε θεραπευτικές προσεγγίσεις νοσημάτων όπως ο καρκίνος του ήπατος.