Βιοχημικές μελέτες ενζύμων του μεταβολισμού του γλυκογόνου

Abstract

Type 2 diabetes mellitus (T2D) is a serious threat to global health constituting a ma-jor socioeconomic problem. Currently, T2D drugs have many adverse side effects, including severe hypoglycemia. Glycogen metabolism is controlled by a number of enzymes in a complex and dynamic manner. Glycogen phosphorylase (GP) and gly-cogen phosphorylase kinase (PhK) are two enzymes that play a critical role in glyco-gen metabolism and in glucose homeostasis. In the framework of this PhD thesis, within the overarching goal to discover new therapeutic agents for T2D, studies on the structure-activity relationship of these two enzymes were performed. GP is a val-idated target for the discovery of new antihyperglycaemic agents for patients with T2D. In the first part, the inhibitory effect of polyphenolic extracts from 19 samples from byproducts of the industrial juicing process of pomegranate (Punica Granatum) and 23 samples from plants of the Rosaceae family was assessed. The most potent inhibitory extracts showed IC50 values below 10 μg / mL. Employing the affinity crys-tallography method, the most bioactive molecules of the extracts were determined. For the pomegranate samples, the most bioactive molecules were ellagic and chlorogenic acid (found bound at the inhibition and active site of the enzyme, re-spectively). For the Rosaceae samples, the most bioactive molecules were glucose, gallic, ellagic and chlorogenic acid found bound at the active, inhibitory, and the new allosteric site, respectively. The binding of chlorogenic acid to GP has not been ob-served thus far, and structural analysis of the GP-chlorogenic acid complex in the crystal revealed the structural basis of its inhibitory activity. Recent studies have highlighted the usefulness of plant extracts in the production of bio-functional food products and the results of this study constitute an important step towards the design of new biofunctional products for T2D patients. Phk phosphorylates the inactive phosphorylase b converting it to the active phosphorylase a. The enzyme is one of the most complex protein kinases, consisting of four subunits (α, β, γ and δ) with heterodimer stoichiometry (αβγδ)4 and a molecular weight of 1.3 MDa. In the sec-ond part of the dissertation, biochemical and biophysical studies of PhK subunits γ and α were performed. Expression studies of human γ truncated subunit of PhK were performed in E. coli strains and then the protein was purified by liquid chroma-tography methods and crystallization tests were performed. The α subunit of the human muscle PhK was also studied. Initially, gene optimization studies were per-formed to express it in the E.coli bacterial system. The amplified gene was inserted into the pETM-11 vector and to enhance its solubility, the molecular chaperone Trig-ger Factor was used. This was followed by chromatographic purification, and bio-physical studies to determine the oligomerization state (DLS), as well as experiments to determine the folding and its secondary structure elements (CD), and final the sample was analyzed for its homogeneity and purity through negative stain EM.

Ο Σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 (ΣΔ2) είναι μια σοβαρή απειλή για την παγκόσμια υγεία, ενώ αποτελεί ένα τεράστιο κοινωνικό και οικονομικό πρόβλημα για τις αναπτυγμένες και αναπτυσσόμενες χώρες. Τα φάρμακα που σχετίζονται με τη θεραπεία της διαταραχής συνδέονται με πολλές αρνητικές παρενέργειες μεταξύ των οποίων και ο κίνδυνος της υπογλυκαιμίας. Ο μεταβολισμός του γλυκογόνου ελέγχεται από ένα πλήθος ενζύμων με πολύπλοκο και δυναμικό τρόπο. Η φωσφορυλάση του γλυκογόνου (GP) και η κινάση της φωσφορυλάσης του γλυκογόνου (PhK) είναι δύο ένζυμα με κρίσιμο ρόλο στο μεταβολισμό του γλυκογόνου και στη ρύθμιση των επιπέδων γλυκόζης στο αίμα. Στο πλαίσιο της διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η σχέση δομής-δράσης των δύο αυτών ενζύμων με απώτερο στόχο την εκμετάλλευσης της παραγόμενης γνώσης στην ανακάλυψη νέων θεραπευτικών μέσων για το ΣΔ2. Η GP αποτελεί έναν επικυρωμένο στόχο για την ανακάλυψη αντιυπεργλυκαιμικών παραγόντων για ασθενείς με ΣΔ2. Στο πρώτο μέρος της διατριβής αξιολογήθηκε η ανασταλτική δράση στη GP, πολυφαινολικών εκχυλισμάτων 19 παραπροϊόντων βιομηχανικής χυμοποίησης ροδιού (Punica Granatum) και 23 φυτών της οικογένειας Rosaceae. Τα πλέον ισχυρά ανασταλτικά εκχυλίσματα εμφάνισαν τιμές IC50 χαμηλότερες από 10 μg/mL. Με τη μέθοδο της κρυσταλλογραφίας συγγένειας προσδιορίστηκαν τα πλέον βιοδραστικά μόρια των εκχυλισμάτων. Για τα εκχυλίσματα από τα παραπροϊόντα βιομηχανικής χυμοποίησης ροδιού τα πλέον βιοδραστικά μόρια ήταν το ελλαγικό και ο χλωρογενικό οξύ που βρέθηκαν συνδεδεμένα στο κέντρο αναστολής και στο καταλυτικό κέντρο του ενζύμου, αντίστοιχα. Για τα εκχυλίσματα των Rosaceae τα πλέον βιοδραστικά μόρια ήταν η γλυκόζη, το ελλαγικό, το γαλλικό και το χλωρογενικό οξύ τα οποία βρέθηκαν συνδεδεμένα στο καταλυτικό κέντρο, στο κέντρο αναστολής και στο νέο αλλοστερικό κέντρο, αντίστοιχα. Η σύνδεση του χλωρογενικού οξέος στην GP παρατηρήθηκε για πρώτη φορά και η δομική ανάλυση του συμπλόκου GP-χλωρογενικού οξέος στον κρύσταλλο, απεκάλυψε την δομική βάση της ανασταλτικής του δραστικότητας. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναδείξει τη χρησιμότητα φυτικών εκχυλισμάτων στην παραγωγή βιολειτουργικών προϊόντων δια-τροφής και τα αποτελέσματα των μελετών της παρούσας διατριβής αποτελούν ένα σημαντικό βήμα για το σχεδιασμό νεών βιολειτουργικών προϊόντων για ασθενείς με ΣΔ2. Η PhK ενεργοποιεί τη φωσφορυλάση b και τη μετατρέπει σε φωσφορυλάση a. Το ένζυμο είναι μία από τις πιο πολύπλοκες πρωτεϊνικές κινάσες, αποτελούμενη από τέσσερις υπομονάδες (α, β, γ και δ) με στοιχειομετρία δεκαεξαμερούς (αβγδ)4 και μοριακό βάρος 1,3 MDa. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, πραγματοποιήθηκαν βιοχημικές και βιοφυσικές μελέτες των υπομονάδων γ και α της PhK. Διεξήχθησαν μελέτες έκφρασης της κολοβωμένης ανθρώπινης ηπατικής υπομονάδας γ της PhK, σε βακτηριακά στελέχη E. coli και στη συνέχεια απομόνωση της μέσω χρωματογραφικού καθαρισμού. Ακολούθησαν δοκιμές κρυστάλλωσης της πρωτεΐνης. Η δεύτερη υπομονάδα που μελετήθηκε ήταν η α από την ανθρώπινη μυϊκή PhK. Αρχικά έγιναν μελέτες βελτιστοποίησης του γονιδίου με σκοπό την έκφρασή της στο βακτηριακό σύστημα E.coli. Το γονίδιο που ενισχύθηκε εισάχθηκε στο φορέα pETM-11. Για την επιτυχή έκφρασή της στο διαλυτό κλάσμα, χρησιμοποιήθηκε ο μοριακός συνοδός Trigger Factor. Στη συνέχεια ακολούθησε χρωματογραφικός καθαρισμός της, και βιοφυσικές μελέτες με σκοπό τον προσδιορισμό της κατάστασης ολιγομερισμού (πειράματα DLS), πειράματα προσδιορισμού του βαθμού αναδίπλωσης και ποσοτικοποίησης των στοιχείων της δευτεροταγούς δομής της (πειράματα CD), ενώ τέλος έγινε ανάλυση της ομοιογένειας και της καθαρότητας του δείγματος μέσω πειραμάτων αρνητικής χρώσης ΕΜ (negative stain EM).