Η επίδραση χορήγησης του συμπλόκου του μη - ιϊκού μεταφορέα DDMC με πλασμίδιο p53 σε πειραματικά προκαλούμενο καρκίνο του πνεύμονα: παθολογοανατομική και ανοσοϊστοχημική εκτίμηση ευρημάτων

Abstract

Introduction Recent advances in the detection of genetic alterations and the clarification of their role in pathogenesis of lung cancer led to the development of powerful and specific targeting therapies based on genetic and biochemical alterations, as well as promising new strategies, such as gene therapy. At present, the main goal in gene therapy is the development of a stable and non-toxic gene vector that can integrate and transfer efficiently genetic material to specific cells, such as cancer cells. Aim To evaluate the safety and efficacy of intratumoral and intravenous administration of non-viral DDMC vector conjugated with p53 plasmid in mice with developed Lewis Lung Carcinoma in comparison with the control group and to correlate the results based on histological and immunohistochemical findings. Material and Methods The study included 30 female mice (C57BL / 6), 7-8 weeks old, in which cancer cells of Lewis Lung Carcinoma cell line (ATCC-CRL-1642) were implanted subcutaneously to their back. The mice were divided into three groups: (a) controls, (b) intravenous and (c) intratumoral. The first group (controls) did not receive any treatment. In the second and third group the DDMC vector / p53 plasmid solution was injected intravenously or intratumorally, respectively, 2 times / week for 3 weeks. During the experiment, the tumor volume was measured once weekly. After the end of the experimental procedure, a necropsy was performed, while tissues and organs were collected. Histological examination and immunohistochemical analysis using p53, Ki-67 and CD34 antibodies on sections of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues was followed. Results The results of intratumoral administration of non-viral vector DDMC conjugated with plasmid p53 (shRNA) showed increased mean survival (17.3 days) compared to the intravenous group (15.75 days) and the control group (12,6 days) (p= 0.029 <0.05) and reduced distant metastasis with presence of lung metastasis to 4/10 (40%) mice compared to the intravenous group (7/10 (70%)) and the control group (100%). In two subjects there were no lung metastasis after 20 and 21 days and six administrations. Macroscopical findings indicated that only in the control group lung metastasis were visible. Tumor growth rate was also controlled in the intratumoral group as well as extensive tumor necrosis was found (45.1%) in comparison to the intravenous group (25%) and the control group (22.9%) (p = 0.000 <0.05). In addition, there was lower expression of histochemical markers p53 and Ki-67 in tumor tissue in the same group (p = 0.034 <0.05 and p = 0.012 <0.05 respectively). No specific histopathological findings observed in the organs of a particular group. Conclusions The administration of non-viral DDMC vector conjuncted with plasmid p53 in mice with developed Lewis Lung Carcinoma seems to be a safe and well tolerated procedure irrespective of the management method (intravenous or intratumoral), while the intratumoral administration more efficiently presents local tumor and distant metastasis control. However, the ideal methodology still has to be investigated as several parameters have to be improved.

Εισαγωγή Πρόσφατες πρόοδοι στον εντοπισμό γενετικών αλλοιώσεων και η αποσαφήνιση του ρόλου τους στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα άνοιξαν το δρόμο για την ανάπτυξη ισχυρών και ειδικών στοχεύουσων θεραπειών με βάση τις γενετικές και βιοχημικές αλλοιώσεις, αλλά και πολλά υποσχόμενων νέων στρατηγικών, όπως η γονιδιακή θεραπεία. Κύριος στόχος της στοχεύουσας γονιδιακής θεραπείας είναι η ανάπτυξη ενός σταθερού και μη τοξικού μεταφορέα γονιδίου, που να μπορεί να ενσωματώνει και να μεταφέρει γενετικό υλικό σε συγκεκριμένα κύτταρα, όπως τα καρκινικά, με αυξημένη αποτελεσματικότητα διαμόλυνσης. Σκοπός Η μελέτη της ασφάλειας και αποτελεσματικότητας της ενδοογκικής και ενδοφλέβιας χορήγησης του μη-ιϊκού μεταφορέα DDMC με πλασμίδιο p53 σε μύες μετά από εμβολιασμό και ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα (Lewis Lung Carcinoma) σε σχέση με τους μάρτυρες, καθώς και η συνεκτίμηση των αποτελεσμάτων με βάση τα ιστολογικά και ανοσοϊστοχημικά ευρήματα. Υλικό-Μέθοδος Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 30 θηλυκοί μύες (C57BL/6), ηλικίας 7-8 εβδομάδων, στους οποίους εμφυτεύθηκαν υποδόρια, στην περιοχή της ράχης, κύτταρα της καρκινικής σειράς ATCC-CRL-1642 (Lewis Lung Carcinoma). Τα πειραματόζωα χωρίσθηκαν σε τρεις ομάδες των δέκα μυών: (α) μαρτύρων, (β) ενδοφλέβιας έγχυσης και (γ) ενδοογκικής έγχυσης. Η πρώτη ομάδα (μάρτυρες) δεν έλαβε θεραπεία. Στη δεύτερη και τρίτη ομάδα έγινε έγχυση του διαλύματος του συμπλόκου DDMC vector/πλασμιδίου p53 ενδοογκικά ή ενδοφλέβια αντίστοιχα, 2 φορές την εβδομάδα για 3 εβδομάδες. Κατά τη διάρκεια του πειράματος μετρούνταν οι διαστάσεις του αναπτυσσόμενου όγκου σε κάθε πειραματόζωο, μία φορά/εβδομάδα. Μετά το πέρας της πειραματικής διαδικασίας, διενεργήθηκε νεκροτομή και συλλογή των προς μελέτη ιστών και οργάνων. Ακολούθησε λήψη τομών για ιστολογική εξέταση (H-E) και διενέργεια ανοσοϊστοχημικών χρώσεων με τους δείκτες p53, Ki-67 και CD34. Αποτελέσματα Στην ομάδα της ενδοογκικής έγχυσης του μη-ιϊκού μεταφορέα DDMC συζευγμένου με πλασμίδιο p53 (shRNA) παρατηρήθηκε αυξημένη επιβίωση (μ.ό. 17,3 ημέρες) συγκριτικά με την ομάδα της ενδοφλέβιας (μ.ό. 15,75 ημέρες) και αυτής των μαρτύρων (μ.ό. 12,6 ημέρες) (p=0,029<0,05) και ελαττωμένες απομακρυσμένες μεταστάσεις με παρουσία πνευμονικών μεταστάσεων σε 4/10 (40%) πειραματόζωα σε σύγκριση με την ομάδα της ενδοφλέβιας έγχυσης (7/10 (70%)) και αυτής των μαρτύρων (100%). Σε δύο δε, μύες δεν παρατηρήθηκαν καθόλου πνευμονικές μεταστάσεις μετά από 20 και 21 ημέρες και έξι χορηγήσεις. Πνευμονικές μακρομεταστάσεις ήταν ορατές μόνο στην ομάδα των μαρτύρων. Στην ομάδα της ενδοογκικής έγχυσης διαπιστώθηκε επίσης, σημαντική αναστολή στο ρυθμό ανάπτυξης του όγκου και εκτεταμένη νέκρωση του όγκου (μ.τ. 45,1%) σε σχέση με την ομάδα της ενδοφλέβιας έγχυσης (μ.τ. 25%) και αυτής των μαρτύρων (μ.τ. 22,9%) (p=0,000<0,05), καθώς και χαμηλότερη έκφραση των ανοσοϊστοχημικών δεικτών p53 και Ki-67 στον ιστό του όγκου (p=0,034<0,05 και p=0,012<0,05 αντίστοιχα). Ειδικές ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις στα όργανα κάποιας συγκεκριμένης ομάδας δεν παρατηρήθηκαν. Συμπεράσματα Η χορήγηση του μη-ιϊκού μεταφορέα DDMC συζευγμένο με πλασμίδιο p53 σε μύες με πειραματικά προκαλούμενο καρκίνο του πνεύμονα (Lewis Lung Carcinoma) φαίνεται να είναι ασφαλής και καλά ανεκτή από τα πειραματόζωα, ανεξάρτητα από τη μέθοδο διαχείρισης (ενδοφλέβια ή ενδοογκική), ενώ μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα όσον αφορά στον έλεγχο του όγκου τοπικά, αλλά και των απομακρυσμένων μεταστάσεων εμφανίζει η ενδοογκική μέθοδος χορήγησης. Ωστόσο, η ιδεώδης μεθοδολογία θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω, καθώς πολλές παράμετροι θα πρέπει να βελτιωθούν.