Νέες τεχνικές πρωτεϊνικής ανάλυσης

Abstract

In the first section of the present dissertation, a method is described for preparation of protein arrays. The method is based on the in vitro expression of recombinant DNA sequences, which are produced via the polymerase chain reaction (PCR). Thus, a DNA array is converted into a protein array, facilitating the steps required for the production and isolation of proteins for immobilization. The second section presents a new nonradioactive approach to the protein truncation test. PCR is used as a synthetic tool for introduction of sequences that allow in vitro expression of the interrogated DNA and for its fusion in-frame upstream of a sequence encoding the photoprotein aequorin. In the absence of a mutation, active aequorin is generated after in vitro expression of the recombinant DNA molecule. On the contrary, any mutation that causes premature termination of translation results in no aequorin production. Finally, it is developed a rapid method for the preparation of biotinylated bioluminescent protein reporters. The method is based on the coupled in vitro transcription and translation of the corresponding DNA sequences, and the simultaneous biotinylation of the produced protein using a biotinylated analogue of the tRNA of lysine. The method was applied to the synthesis of biotinylated firefly luciferase and Renilla luciferase, avoiding the time-consuming steps of the interrogated cDNA’s expression in vivo, purification of the recombinant protein and conjugation with molecules which recognize the analyte.

Στο πρώτο μέρος της διδακτορικής διατριβής, αναπτύχθηκε μέθοδος παρασκευής συστοιχιών πρωτεϊνών, η οποία βασίζεται στην in vitro έκφραση μορίων DNA, που παράγονται με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Με τον τρόπο αυτό, μια συστοιχία DNA μετατρέπεται σε συστοιχία πρωτεϊνών, παρακάμπτοντας τα χρονοβόρα στάδια της κλωνοποίησης των επιθυμητών αλληλουχιών cDNA, της in vivo έκφρασής τους και της απομόνωσης των πρωτεϊνών. Στη δεύτερη ενότητα περιγράφεται μια νέα, μη ραδιοϊσοτοπική μέθοδος για τη δοκιμασία πρόωρου τερματισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης. Στην προτεινόμενη μέθοδο, με τη χρήση της PCR ως συνθετικό εργαλείο, ενσωματώθηκε καθοδικά της εξεταζόμενης αλληλουχίας DNA η κωδικοποιούσα αλληλουχία της φωτοπρωτεΐνης ακουορίνης, διατηρώντας το ίδιο πλαίσιο ανάγνωσης. Μετά από έκφραση in vitro του ανασυνδυασμένου μορίου DNA, πραγματοποιείται άμεσος έλεγχος της ολοκλήρωσης ή μη της πρωτεϊνοσύνθεσης, μέσω της αντίδρασης της ακουορίνης, αποφεύγοντας τα πολύωρα στάδια της ηλεκτροφόρησης και της αυτοραδιογραφίας. Τέλος αναπτύχθηκε μέθοδος παρασκευής βιοτινυλιωμένων βιοφωταυγών ιχνηθετών, η οποία βασίζεται στην in vitro συζευγμένη μεταγραφή, μετάφραση και βιοτινυλίωση των παραγόμενων πρωτεϊνών. Έγινε σύνθεση των φωτοφερασών της πυγολαμπίδας και της Renilla, αποφεύγοντας τα στάδια κλωνοποίησης και έκφρασης των γονιδίων σε βακτήρια, της απομόνωσης των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και της σύζευξής τους με μόρια αναγνώρισης του αναλύτη.