Μελέτη της έκφρασης σε μοριακό επίπεδο mRNA των αποπτωτικών γονιδίων της BCL-2 οικογένειας (BCL-2, BAX, BCL2L12) στον αρθρικό χόνδρο σε πειραματικό ζωικό πρότυπο οστεοαρθρίτιδας

Abstract

Background Given that apoptosis of chondrocytes is one of the most important factors related to the pathogenesis of osteoarthritis (OA), the recent research interest adds progress not only to the knowledge of the molecular signals that mediate apoptosis but also to find new therapeutic targets. This study attempts to investigate the differential expression of BCL2 family genes in the articular cartilage of an experimental animal model of osteoarthritis. Methods In total, 26 New Zealand white rabbits underwent an anterior cruciate ligament transaction, 26 more were subjected to a placebo surgery and 18 specimens constituted the control non-operated group. Thirteen weeks later, samples of cartilage from the osteoarthritic and non-osteoarthritic knees were collected and subjected to analysis of the BCL2, BAX and BCL2L12 gene expression at the mRNA level. Results Installed osteoarthritic alterations of varied intensity and of Grade 1 up to Grade 5, were confirmed according to the OARSI system. Contrary to the physiologically healthy samples, in the osteoarthritic samples the mRNA expression levels of BAX and BCL2L12 genes were found significantly upregulated by signals which can activate apoptosis. However, the difference between BCL2 mRNA expression levels in healthy and osteoarthitic samples was not supported statistically. Conclusions Since apoptosis is the main feature of the cartilage degeneration in osteoarthritis, the effective inhibition of apoptosis of chondrocytes can provide novel and interesting therapeutic strategies for the treatment of OA. Therefore, BAX and BCL2L12 are highlighted as potential therapeutic targets in osteoarthritis.

Υπόθεση: Παρόλο που η απόπτωση των χονδροκυττάρων είναι ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες που συμβάλλουν στην πρόκληση και εξέλιξη της OA η παθογένεια της νόσου παραμένει μέχρι σήμερα ελάχιστα κατανοητή ενώ τα διάφορα είδη ΟΑ δεν έχουν καμία κοινή παθοφυσιολογική οδό, αλλά μόνο ένα κοινό τελικό στάδιο. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η απόπτωση των χονδροκυττάρων είναι ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες που αφορούν στην παθογένεση της OA η εστίαση του ερευνητικού ενδιαφέροντος στα μοριακά σήματα που μεσολαβούν στην απόπτωση των αρθρικών χονδροκυττάρων αποτελεί πρόοδο στην προσπάθεια εύρεσης θεραπευτικών στόχων. Έτσι στην παρούσα έρευνα μελετάται η διαφορά έκφρασης των αποπτωτικών γονιδίων της BCL-2 ομάδας (BCL-2, BAX, BCL2L12) στον αρθρικό χόνδρο σε πειραματικό ζωικό πρότυπο οστεοαρθρίτιδας. Υλικό & Μέθοδοι: Συνολικά, χρησιμοποιήθηκαν εβδομήντα λευκά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας. Τα 26 από αυτά υποβλήθηκαν σε διατομή πρόσθιου χιαστού συνδέσμου (ΠΧΣ). Μια δεύτερη ομάδα 26 κουνελιών υποβλήθηκε σε «placebo» χειρουργείο, δηλαδή προσπέλαση διατομή αρθρικής μεμβράνης και σύγκλιση τραύματος συμπεριλαμβανομένης της αρθρικής μεμβράνης. Τα υπόλοιπα 18 δεν χειρουργήθηκαν και αποτέλεσαν την ομάδα αναφοράς (control). Ύστερα από δεκατρείς εβδομάδες ακολούθησε ευθανασία σε όλα τα ζώα και έγινε συλλογή ιστοτεμαχίων από τον οστεοαρθρικό και μη οστεοαρθρικό χόνδρο και από τα δύο ζεύγη γονάτων. Οι μοριακές τεχνικές για την ανάλυση έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων σε επίπεδο mRNA περιέλαβαν με τη σειρά ομογενοποίηση ιστού, απομόνωση και έλεγχο της ποιότητας του RNA, κατασκευή cDNA, σύνθεση εκκινητών και real-time PCR για την επιλεκτική ενίσχυση και τον ποσοτικό προσδιορισμό της έκφρασης των μελετούμενων γονιδίων. Αποτελέσματα: Η εκτίμηση της κατάστασης των αρθρικών χόνδρων και των αλλοιώσεών τους με το σύστημα OARSI επιβεβαίωσε εγκατεστημένες οστεοαρθριτικές αλλοιώσεις, ποικίλης έντασης και Grade 1 έως και 5. Σε αντίθεση με τα φυσιολογικά υγιή δείγματα, στα οστεοαρθριτικά δείγματα η έκφραση των ΒΑX και ΒCL2L12 βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω από σήματα που επάγουν την απόπτωση. Οι όποιες διαφορές της έκφρασης της BCL-2 μεταξύ υγιών και οστεοαρθιτικών δειγμάτων δεν στηρίζονται στατιστικά. Συμπεράσματα: Κατά την εξέλιξη της νόσου της οστεοαρθρίτιδας, είναι αναμενόμενη η προώθηση της αποπτωτικής διαδικασίας και η επικράτηση των προ-αποπτωτικών έναντι των αντι-αποπτωτικών μελών της οικογένειας BCL-2. Στην προσπάθεια ερμηνείας της αύξησης της έκφρασης της προ-αποπτωτικής πρωτεΐνης BAX δεν συναντώνται ιδιαίτερα προβλήματα αφού η εξέλιξη της νόσου της οστεοαρθρίτιδας, συνοδεύεται από την προώθηση της αποπτωτικής διαδικασίας. Επίσης, η ύπαρξη πολλών διαφορετικών μεταξύ τους ισομορφών της ΒCL2L12 αποτελεί ιδιαίτερης σημασίας εφόδιο για την ερμηνεία της υπερέκφρασης της ΒCL2L12 στους οστεοαρθριτικούς χόνδρους ως προ-αποπτωτικό μέλος.