Μελέτη του νέου αποπτωτικού γονιδίου BCL2L12

Abstract

The aim of this thesis is expression analysis and clinical evaluation of the novel apoptosis-related gene BCL2L12 in human leukemia cells and patients with acute myeloid leukemia. Scorilas et al., recently, discovered and cloned a new member of the BCL2 gene family, BCL2L12, that it was found to be implicated in many types of solid tumors having promising differential diagnostic and prognostic value. During the first part of the thesis, HL60 human leukemia cells stimulated with the common chemotherapeutic agents topotecan, methotrexate, etoposide, vincristine, taxol and As2O3. These antineoplastic drugs are able to cause cell death, in HL60 cels, through the induction of apoptosis. The kinetics of the induction of apoptosis and cell toxicity were investigated by DNA laddering and MTT method, respectively. Total RNA was extracted and cDNA was prepared by reverse transcription. The studied genes were amplified by PCR using gene specific primers. Expression of the genes was evaluated based on ethidium bromide visualization of the PCR product on agarose gels. Β-ACTIN and GAPDH were used as housekeeping genes. For the first time, significant modulations in the BCL2L12 mRNA expression, after the studied drug stimulation in HL60 cells, were observed. In the cases of topotecan and etoposide-induced apoptosis, the results showed a downregulation of BCL2L12 mRNA in the late stages of apoptosis. After treatment with either vincristine or taxol, we observed an increased mRNA expression of both BCL2L12 and BCL2, in the beginning of apoptosis and a gradual downregulation of the mRNA expression of these genes through the progression of apoptotic phenomenon. In the case of methotrexate-induced apoptosis, we also observed a decrease in the mRNA expression of BCL2L12, 6h after drug treatment. Finally, a gradual downregulation of BCL2L12 m RNA level was demonstrated after treatment of the HL-60 cell line with As2O3. These modulations in the expression of BCL2L12 gene, after treatment of the leukemia cells with these drugs, may be an underlying mechanism through, as yet, unknown apoptotic pathways. These observations may be due to the pro-apoptotic or anti-apoptotic effects of the gene. During the second part of the thesis, the expression of the novel apoptosis related gene, BCL2L12, in blood samples from patients with acute myeloid leukaemia and healthy controls were also, for the first time, investigated. A highly sensitive quantitative real time (QRT-PCR) methodology, using the SYBR Green I chemistry, has been used for BCL2L12 quantification in blood from the selected patients. Follow-up information was available for a statistical significant size of the leukemia patients (n=46). A computerized database containing all the information concerning each patient was available for statistical analysis. The associations between mRNA expression level of the novel gene BCL2L12 and clinical/pathological characteristics were evaluated by using chi-square test (χ2) or the Fisher’s exact test, where appropriate. According to our clinical study, leukemia patients with positive BCL2L12 expression status (according to calculated optimal cut-off) were 3 times more likely to relapse or die than patients with negative BCL2L12 expression. In addition, statistical significant relationships (p<0.05) were found between BCL2L12 expression and CD117, Splenomegaly and Chemotherapy Response. Therefore, our data support the hypothesis that BCL2L12 may be characterized as a new prognostic marker in acute myeloid leukemia.

Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάλυση έκφρασης και η κλινική αξιολόγηση του νέου αποπτωτικού γονιδίου BCL2L12 σε λευχαιμικά κύτταρα και σε ασθενείς με οξεία μυελογενή λευχαιμία. Tο γονίδιο BCL2L12, ανακαλύφθηκε και κλωνοποιήθηκε από τους Scorilas et al, ενώ βρέθηκε να εμπλέκεται και να έχει σημαντική διαφοροδιαγνωστική και προγνωστική αξία σε αρκετές μορφές στερεών όγκων. Στην πρώτη φάση διατριβής, προσδιορίσθηκε και μελετήθηκε η έκφραση, σε επίπεδο mRNA, του γονιδίου BCL2L12, καθώς και άλλων σχετιζόμενων με την απόπτωση γονιδίων, παρουσία αντικαρκινικών φαρμάκων, στη λευχαιμική κυτταρική σειρά HL60. Χρησιμοποιήθηκαν τα κυτταροστατικά φάρμακα τοποτεκάνη (topotecan), μεθοτρεξάτη (methotrexate), ετοποσίδη (etoposide), βινκριστίνη (vincristine), ταξόλη (taxol) και οξείδιο του αρσενικού (As2O3) σε συγκέντρωση διαλύματος κυττάρων της τάξης του 12x105 κύτταρα/ml. Η κυτταρική βιωσιμότητα εκφράστηκε ως το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων μιας κυτταροκαλλιέργειας και προσδιορίστηκε με την εκτίμηση ζωτικών κυτταρικών λειτουργιών, όπως είναι η μεταβολική δραστηριότητα των μιτοχονδρίων (MTT). Προσδιορίστηκαν χρονικά σημεία πριν και μετά την εμφάνιση της απόπτωσης με τη μέθοδο της κλιμακωτής διαβάθμισης (DNA laddering), καθώς και με κυτταρομετρία ροής με διπλή χρώση Αννεξίνης V / PI, μετά από κατεργασία με τριοξείδιο του αρσενικού. Από τα δείγματα αυτά απομονώθηκε το RNA και με τη μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφής (RT) έγινε μετατροπή του σε cDNA. Ακολούθησε πολλαπλασιασμός των μελετώμενων γονιδίων με τη μέθοδο της συμβατικής PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για κάθε γονίδιο. Ο έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης έγινε μετά από ηλεκτροφόρηση ίσης ποσότητας προϊόντων των PCR σε πηκτή αγαρόζης που περιείχε βρωμιούχο αιθίδιο, χρησιμοποιώντας ως γονίδια αναφοράς είτε τη β-ακτίνη (ACTB), είτε το GAPDH. Τα αποτελέσματα έδειξαν, για πρώτη φορά διεθνώς, σημαντικές μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης του BCL2L12 παρουσία των μελετώμενων κυτταροστατικών φαρμάκων. Πιο συγκεκριμένα, στην περίπτωση της μεθοτρεξάτης, παρατηρήθηκε αύξηση της mRNA έκφρασης του BCL2L12, ενώ στις περιπτώσεις των ετοποσίδης και τοποτεκάνης παρατηρήθηκε μια σαφής μείωση, κυρίως στο χρονικό σημείο που υπήρχαν έντονα αποπτωτικά φαινόμενα. Στην περίπτωση της βινκριστίνης και ταξόλης, εμφανίστηκε μια απότομη, αύξηση της έκφρασης του γονιδίου στην αρχή της απόπτωσης, που ευθύς αμέσως μετά μειώθηκε, συμπεριφορά αντίστοιχη με αυτή του πιο αναγνωρισμένου αντιαποπτωτικού γονιδίου, του BCL2, του οποίου η έκφραση μελετήθηκε παράλληλα με αυτή του BCL2L12, στα ίδια χρονικά σημεία. Όσον αφορά στο τριοξείδιο του αρσενικού, σημειώθηκε μια σημαντική πτώση στα επίπεδα mRNA, κυρίως του μεταγράφου BCL2L12A, σε προχωρημένα στάδια της αποπτωτικής διαδικασίας. Τα συγκεκριμένα εργαστηριακά αποτελέσματα συνέβαλαν στο να αποσαφηνιστεί περισσότερο η συμπεριφορά του γονιδίου μετά την επίδραση γνωστών κυτταροστατικών φαρμάκων σε μια λευχαιμική, κυτταρική σειρά, όπως η HL-60 και πιθανόν ο ρόλος του γονιδίου μέσα σε αποπτωτικές πορείες, που επάγονται μετά τη χρήση των συγκεκριμένων φαρμάκων, που ούτως ή άλλως δεν έχουν ακόμα διαλευκανθεί πλήρως. Στη δεύτερη φάση της διατριβής, εφαρμόστηκε υψηλής ευαισθησίας ποσοτική μέθοδος ανάλυσης της έκφρασης του γονιδίου BCL2L12, τόσο σε δείγματα ολικού αίματος ασθενών με οξεία μυελογενή λευχαιμία, όσο και σε δείγματα υγιών ατόμων. Χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία της ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (Quantitative Real Time PCR) και η χρωστική SYBR-Green I. Συλλέχθηκε ένα στατιστικά σημαντικό μέγεθος δείγματος ασθενών με οξεία μυελογενή λευχαιμία με πλήρες ιατρικό ιστορικό (n=46). Ακολούθησε ανάλυση έκφρασης του γονιδίου BCL2L12 και εκτενής βιοστατιστική ανάλυση. Από την ανάλυση προέκυψαν, για πρώτη φορά διεθνώς, σημαντικά συμπεράσματα, συσχετίζοντας, σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (p<0,05), την έκφραση του BCL2L12 με την ανταπόκριση των ασθενών στη χημειοθεραπεία, το χρόνο επιβίωσης των ασθενών χωρίς υποτροπή και το συνολικό χρόνο επιβίωσής τους. Έτσι ασθενείς που ήταν θετικοί ως προς το BCL2L12 (σύμφωνα με το υπολογιζόμενο βέλτιστο όριο λήψης απόφασης) βρέθηκαν να έχουν 3 περισσότερες πιθανότητες να υποτροπιάσουν ή να πεθάνουν, σε σχάση με τους ασθενείς που ήταν αρνητικοί ως προς την έκφραση του γονιδίου BCL2L12. Οπωσδήποτε, θα πρέπει να λάβουν χώρα και άλλα πειράματα στο μέλλον, ώστε να επιβεβαιωθεί το ενδεχόμενο μελλοντικής χρησιμοποίησής του ως δείκτη πρόγνωσης της λευχαιμίας και πιθανόν και άλλων μορφών καρκίνου.