Synthesis of charged cyclodextrins for encapsulation of antibiotics

Abstract

Antimicrobial resistance is a contemporary serious threat to public health due to theworldwide spread of resistant bacterial strains that severely disempower the effectivenessof existing antibiotics. Apart from the discovery of new drugs, the elaboration of methodsto suppress resistance and repotentiate drugs is a much desired solution to this severeproblem. The employment of cyclodextrins as nanosized host molecules to protectantibiotics from resistance-conferring bacterial enzymes could be proposed as ananotechnological approach towards this end. Cyclodextrins (CDs) consist of 6, 7 or 8 α-1,4-linked D-glucopyranose units to form macrocyclic oligosaccharides (α-, β- or γ-CD,respectively) which are used as pharmaceutical excipients, thanks to their ability toenhance the water solubility and stability of hydrophobic drugs upon formation ofsupramolecular host : guest complexes. In this dissertation, multifunctional CD-basednanocarriers have been designed, synthesized and studied in detail towards protection andrepotentiation of antibiotics against resistant infections. In a first approach,comprehensive NMR and ITC studies were undertaken to screen four β-lactam antibioticswith a panel of natural and specifically synthesized CDs, in order to investigate theeffects of host size, flexibility and end-group charges on the binding with the drugs. Thestudy has completely defined the structural requirements and the associated strengths andlimitations regarding CD : penicillin complexation. Therefore, the results showed that ofall CDs studied, the engineered cysteamine-appended γ-CD (GCYS) forms the strongestinclusion complex with oxacillin (OXA, an antistaphylococcal penicillin) during anenthalpically and entropically favored process resulting in ΔGb = -18.5 kJ mol-1 and Kb ≈1700 M-1 at 37 ºC. Moreover, GCYS protects OXA from hydrolysis by a specific oxa-1β-lactamase enzyme produced by E. coli, reducing the corresponding rate by 2.3-fold.Finally, GCYS is also able to penetrate the cell walls of macrophages, thus it can beproposed as an effective delivery system for OXA to mammalian cells. The findings mayhave important implications since phagocytosis of invading infectious bacteria plays akey role in host immune defense. It is then plausible to propose that increasedconcentrations of antibiotics within macrophages via entry of GCYS/antibioticcomplexes may enhance bacterial killing. In another approach, a combination of detailedNMR and UV-Vis spectroscopic investigations highlighted the ability of heptakis(2,6-di-O-methyl)-βCD (DIMEB), among different methylated CD derivatives, to formcomplexes with rifampicin, an ansamycin antibiotic used as first-line treatment oftuberculosis. Enhanced water solubility and long-term stability of rifampicin wasachieved upon complexation with DIMEB in neutral conditions via formation of a strong,2 : 1 complex (Kb1 ≈ 3000 M-1, Kb2 ≈ 10 M-1) at the piperazine site of the drug,accompanied by two more binding sites responsible for weaker bindings. A decreasedhost : guest affinity (Kb ≈ 400 M-1) was observed at acidic pH due to the completeprotonation of the piperazine moiety. Overall, the results suggested that DIMEB couldserve as a suitable delivery system conferring improved stability and pH-dependentrelease of the drug (e.g. in the stomach) for possible oral formulations. Finally, themultistep synthesis of CDs bearing carboxylate moieties was undertaken. The structuraldetails, the protonation states at neutral pH as well as the metal chelating and host : guestcomplexation abilities of these macrocyclic host compounds have been extensivelystudied with NMR spectroscopy, potentiometry, ITC and theoretical calculations. Datashowed the compounds to be zwitterionic and anionic at physiological pH and to formmultimetal complexes with metal cations. Moreover, it was found that the cavity of someof the hosts is stiffly open and thus available for guest inclusion, while that of others isobstructed, due to structural distortion precluding guest inclusion.

Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας των παθογόνων μικροβίων έναντι γνωστών αντιβιοτικώναποτελεί ευρέως διαδεδομένη σοβαρή απειλή για την δημόσια υγεία σε παγκόσμιακλίμακα. Για την αντιμετώπιση του προβλήματος, εκτός από την δαπανηρή καιχρονοβόρα ανάπτυξη νέων αντιβιοτικών, η επανευαισθητοποίηση των μικροβίων έναντιτων υπαρχόντων φαρμάκων αποτελεί εξαιρετικά επιθυμητό στόχο. Η εφαρμογήκυκλοδεξτρινών έναντι του στόχου αυτού προτείνεται ως νανοτεχνολογική προσέγγισηπροστασίας αντιβιοτικών από την δράση εξειδικευμένων ενζύμων τα οποία προσδίδουνανθεκτικότητα στα μικρόβια. Οι κυκλοδεξτρίνες (CDs) αποτελούν οικογένεια κυκλικώνολιγομερών (εξαμερή, επταμερή, οκταμερή) της α-D-γλυκοπυρανόζης με σύνδεση α-1,4-(α-, β- και γ-CD, αντιστοίχως). Οι CDs είναι εγκεκριμένα έκδοχα λόγω την ιδιότητάςτους να αυξάνουν την διαλυτότητα και την σταθερότητα υδρόφοβων φαρμάκωνσχηματίζοντας υπερμοριακά σύμπλοκα ξενιστή : ξενιζομένου μορίου. Στην παρούσαδιατριβή επιχειρείται ο σχεδιασμός, η σύνθεση και ο λεπτομερής χαρακτηρισμόςεξειδικευμένων παραγώγων CDs και η μελέτη τους ως πρoς την ικανότητα ναεμποδίζουν την δράση των μηχανισμών ανθεκτικότητας συγκεκριμένων παθογόνωνμικροβίων. Η πρώτη προσέγγιση περιλαμβάνει την σύνθεση σειράς φορτισμένων CDsκαι την μελέτη τους με σειρά β-λακταμικών αντιβιοτικών ώστε να διερευνηθεί ηεπίδραση του μεγέθους, της ευκαμψίας και των τελικών φορτισμένων ομάδων των CDsστην δημιουργία συμπλόκων στο διάλυμα. Εκτενείς μελέτες με φασματοσκοπία NMRκαι θερμιδομετρία ITC ανέδειξαν την κυστεαμινο-υποκατεστημένη γ-CD (GCYS) ως τονικανότερο νανοφορέα για την οξακιλλίνη (ενθαλπικώς και εντροπικώς ευνοούμενοσύμπλοκο με Kb ≈ 1700 M-1 και ΔGb = -18.5 kJ mol-1, 37 °C). Το σύμπλοκο επιβραδύνει2.3 φορές την υδρόλυση της οξακιλλίνης από την ειδική β-λακταμάση oxa-1 ενώ εδείχθηκαι η ικανότητα της GCYS να διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη και να συγκεντρώνεταιστο εσωτερικό μακροφάγων χωρίς να παρουσιάζει τοξικότητα in-vitro. Τα ανωτέρωμπορεί να έχουν ιδιαίτερες επιπτώσεις στην άμυνα έναντι μικροβίων, αν θεωρήσει κανείςπιθανή την ενδοκυτταρική μεταφορά GCYS/αντιβιοτικών και την συσσώρευσή τουςώστε να ενισχυθεί η ικανότητα μακροφάγων για καταστροφή των μικροβίων. Η επόμενηπροσέγγιση ανέδειξε, μέσω λεπτομερών μελετών με φασματοσκοπία NMR και UV-Vis,την ικανότητα της επτάκις(2,6-δι-Ο-μεθυλο)-βCD (DIMEB) να συμπλέκεται ισχυρά μετην ριφαμπικίνη, δραστικό αντιβιοτικό της κατηγορίας των ανσαμυκηνών,χρησιμοποιούμενο στην θεραπεία της φυματίωσης και άλλων λοιμώξεων. Η ενισχυμένηυδατοδιαλυτότητα και πολυήμερη σταθερότητα της ριφαμπικίνης ως συμπλόκου με τηνDIMEB σε ουδέτερο pH (κυρίως 1 : 1 σύμπλοκο, Kb ≈ 3000 M-1) αποδίδεται σεσχηματισμό συμπλόκου μέσω του πιπεραζινικού τμήματος του μορίου, αλλά και μέσωδύο ακόμα θέσεων σύνδεσης που συμμετέχουν ασθενώς. Σημαντική μείωση τηςυπερμοριακής σύνδεσης παρατηρείται σε pH 4 (Kb ≈ 400 M-1), προφανώς λόγω μερικήςπρωτονίωσης του πιπεραζινικού δακτυλίου. Τα ανωτέρω ευρήματα δείχνουν ότι ηDIMEB αποτελεί κατάλληλο νανοφορέα για βελτιωμένη βιοδιαθεσιμότητα τουαντιβιοτικού, με την επιπρόσθετη ιδιότητα της απελευθέρωσής του σε όξινο pH,επομένως δυνάμει εφαρμόσιμο σε σκεύασμα για από στόματος χορήγηση. Η τελευταίαπροσέγγιση, περιλαμβάνει την σύνθεση μέσω πολλαπλών σταδίων σειράς CDs μεκαρβοξυλικούς υποκαταστάτες. Η δομική ανάλυση, οι καταστάσεις πρωτονίωσης και ηικανότητα σχηματισμού συμπλόκων με μέταλλα και ξενιζόμενα μόρια μελετήθηκανδιεξοδικά με φασματοσκοπία NMR, θερμιδομετρία ITC, ποτενσιομετρία καιθεωρητικούς υπολογισμούς. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ενώσεις είναι συνολικώςανιόντα με αμφιτεριοντικό χαρακτήρα σε φυσιολογικό pH τα οποία σχηματίζουνπολυμεταλλικά σύμπλοκα με κατιόντα μετάλλων. Επί πλέον, η κοιλότητα μερικών είναιανοικτή και επομένως διαθέσιμη για εγκλωβισμό μορίων, ενώ άλλων δεν είναιπροσβάσιμη λόγω μακροκυκλικής στρέβλωσης και αποκλεισμού των ανοιγμάτων