Μελέτες των μηχανισμών του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού σε εμβρυονικούς ινοβλάστες ποντικού

Abstract

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) by the co-expression of OSKM (Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc) is a prolonged, asynchronous and inefficient process of many intermediate stages and molecular obstacles. In order to understand the dynamic nature of reprogramming, it’s highly required both the identification and characterization of transcriptional regulators that drive different cell types to pluripotency. We reprogrammed Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) and mouse Hepatocytes (mHeps) upon OSKM lentiviral transduction and we discovered that cellular reprogramming occurs through two “waves” of transcriptional changes and identified a gene regulatory network composed of 9 Transcriptional Regulators (TRs; Cbfa2t3, Gli2, Irf6, Nanog, Ovol1, Rcan1, Taf1c, Tead4 and Tfap4), which are directly targeted by OSKM. Single-cell gene expression experiments revealed that the 9 TRs are (co)-expressed in a remarkably small number of cells, the pre-iPSCs colonies. These results can explain the low percentage of reprogrammed cells and the dual nature of cellular reprogramming (stochastic and deterministic). ChIP-seq experiments for the OSKM genomic DNA binding and distribution in different timepoints of the process revealed that the dynamic OSKM DNA binding causes a strong chromatin reorganization, where Oct4 pre-marks Sox2, Klf4 and Myc binding sites. Thus, the prime OSKM DNA binding and the subsequent stochastic co-expression of 9 TRs in a specific subset of reprogrammed cells induce the reconstruction of a gene regulatory network crucial for the generation of iPSCs.

Ο κυτταρικός επαναπρογραμματισμός για τη δημιουργία επαγόμενων πολυδύ-ναμων βλαστοκυττάρων (iPSCs), μέσω της ταυτόχρονης υπερέκφρασης των Oct4, Sox2, Klf4 και c-Myc (OSKM) μεταγραφικών ρυθμιστών, είναι μία χρονοβόρα, ασύγχρονη και μη αποτελεσματική διαδικασία που περιλαμβάνει αρκετά ενδιάμεσα στάδια και χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη μεγάλου αριθμού μοριακών εμποδίων τα οποία θα πρέπει να ξεπεραστούν. Για να μελετήσουμε τη δυναμική φύση αυτής της διαδικασίας, είναι απαραίτητο όχι μόνο να ταυτοποιηθούν, αλλά και να χαρακτηριστούν οι μεταγραφικοί ρυθμιστές που καθοδηγούν τη διαδικασία έτσι ώστε διαφορετικοί κυτταρικοί τύποι να μεταβούν σε κατάσταση πολυδυναμικότητας. Επαναπρογραμματίσαμε εμβρυονικούς ινοβλάστες (MEFs) και ηπατοκύτταρα ποντικού (mHeps), με την χρήση κατάλληλης πειραματικής πλατφόρμας, στην οποία χρησιμοποιείται λεντιϊκο σύστημα επαγώμενης γονιδιακής έκφρασης των OSKM. Ανακαλύψαμε ότι η διαδικασία του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού περιλαμβάνει δύο διαδοχικά «κύματα» μεταγραφικών αλλαγών και ταυτοποιήσαμε 9 μεταγραφικούς ρυθμιστές (9ΜΡ) οι οποίοι συγκροτούν ένα ρυθμιστικό γονιδιακό δίκτυο, αποτελούν άμεσους στόχους των OSKM και είναι απολύτως απαραίτητοι για τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό και των δύο κυτταρικών τύπων. Τα πειράματα μελέτης του προτύπου έκφρασης των 9ΜΡ σε μοναδιαία κύτταρα, αποκάλυψαν ότι η πλειοψηφία τους (συν)-εκφράζεται επιλεκτικά σε ένα μόνο μικρό αριθμό κυττάρων, τα οποία αποτελούν πρόδρομα κύτταρα iPSCs (pre-iPSCs colonies). Tα αποτελέσματα αυτά εξηγούν εν μέρει την χαμηλή αποτελεσματικότητα του φαινομένου του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού, καθώς επίσης και τη διττή φύση του (στοχαστική και ντετερμινιστική). Πειράματα μελέτης της κατανομής των OSKM στο γονιδίωμα (ChIP-seq) σε διαφορετικά χρονικά σημεία του επαναπρογραμματισμού, αποκάλυψαν μια πρωτόγνωρη δυναμική διαδικασία πρόσδεσης στο DNA η οποία έχει ως αποτέλεσμα την αναδιοργάνωση της χρωματίνης. Συγκεκριμένα, τα πειράματα έδειξαν ότι ο Oct4 προσδένεται σε συγκεκριμένους γονιδιακούς στόχους δημιουργώντας τις κατάλληλες συνθήκες για την επακόλουθη πρόσδεση των Sox2, Klf4 και Myc. Ανακεφαλαιωτικά, η πρώιμη πρόσδεση των OSKM και η επακόλουθη στοχαστική συνέκφραση σημαντικών μεταγραφικών ρυθμιστών σε συγκεκριμένους κυτταρικούς υποπληθυσμούς επάγει την δημιουργία ενός ρυθμιστικού γονιδιακού δικτύου που καθορίζει τη μετάβαση προς την πολυδυναμικότητα.