Παραγωγή, χαρακτηρισμός και ρεολογικές ιδιότητες του πολυσακχαρίτη κεφιράνη

Abstract

Kefiran, an exocellular heteropolysaccharide was produced using kefir grains of household origin as a starter culture and Ultra High Temperature-Treated skimmed bovine milk as the substrate. The multiplication of kefir grains was carried out in three production stages for scaling up purposes. Initially, the kefir grains were produced in 1 L capacity fermenters, testing various fermentation conditions such as percentage of grain inoculum and incubation temperature. Following process conditions optimization, the fermentation was carried out in a 12 L capacity fermenter to collect a quantity of grains sufficient for utilization as starter culture material in a larger fermenter of 428 L capacity, achieving the total production of 30 kg grains out of an initial quantity of starter culture of 80 g.Kefiran isolation from kefir grains and the subsequent purification process involved the following steps; heating at 80°C of the aqueous suspension of kefir grains followed by homogenization, addition of perchloric acid, centrifugation to separate kefiran from proteins, repeated washings with surplus of ethanol, followed by centrifugation and freeze drying of the precipitate to obtain kefiran in powder form. Conformational studies using techniques such as capillary viscometry, size exclusion chromatography, multi angle laser light scattering, dynamic light scattering and zeta potential revealed that kefiran molecule in aqueous solutions behaved as a random coil having a weight average molecular weight of approximately 7 x 105. Water was found to be a good solvent for kefiran whose molecule was slightly negative charged. Hydrodynamic studies employing various aqueous environments of different ionic strengths, pH values, presence of organic acids, sugars, urea and ethanol affected the conformation of kefiran molecule in various degrees. Rheological studies of kefiran aqueous solutions (0.25 to 4%) indicated that kefiran in solution was a pseudoplastic material. Samples of 1 to 4% kefiran concentration which were frozen and then thawed exhibited higher viscosity values than their counterparts which did not undergo the freeze-thaw cycle. Squeeze flow experiments of kefiran systems which underwent the freeze-thaw cycle, revealed that the elongation viscosity exhibited, was concentration dependent, at the range of 4 to 7% concentration, whereas, the sample with 10% kefiran concentration exhibited the behavior of a true gel. Rheological studies of kefiran-milk proteins systems revealed that the influence of the kefiran’s presence on mechanical properties of the systems was almost negligible. Confocal laser scanning microscopy confirmed that the structure of these kefiran systems was dominated by the presence of milk proteins and to a lesser extent by the presence of kefiran.The findings of the present study indicated that kefiran containing food systems subjected to freeze-thaw treatment, will acquire a very stable, cohesive structure ideal for various food applications as far as consumer acceptance is concerned.

Η κεφιράνη, ένας εξωκυτταρικός ετεροπολυσακχαρίτης, παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας ως καλλιέργεια εκκίνησης κόκκους κεφίρ, οι οποίοι επωάστηκαν σε αγελαδινό αποβουτυρωμένο γάλα μακράς διάρκειας. Ο πολλαπλασιασμός των κόκκων πραγματοποιήθηκε σε τρεις κύκλους επώασης. Αρχικά και προκειμένου να μελετηθούν και οι βέλτιστες συνθήκες πολλαπλασιασμού (ποσοστό εμβολιασμού κόκκων και θερμοκρασία επώασης), οι κόκκοι κεφίρ επωάστηκαν σε ζυμωτήρες χωρητικότητας 1 L. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ζυμωτήρας χωρητικότητας 12 L, ώστε να παραχθεί επαρκής ποσότητα κόκκων και να συνεχιστούν τα πειράματα ζυμώσεων σε μεγαλύτερης χωρητικότητας ζυμωτήρα (428 L). Συνολικά παρήχθησαν 30 kg κόκκων ξεκινώντας από αρχική ποσότητα 80 g.Για την απομόνωση της κεφιράνης και την παραλαβή της με υψηλό βαθμό καθαρότητας, χρησιμοποιήθηκε κατάλληλη μεθοδολογία, η οποία περιλάμβανε τα εξής στάδια: θέρμανση στους 80°C και ανάδευση υδατικού αιωρήματος κόκκων κεφίρ, κατεργασία του αιωρήματος με υπερχλωρικό οξύ και φυγοκέντρηση για την κατακρήμνιση των πρωτεϊνών, επαναλαμβανόμενες καταβυθίσεις με περίσσεια αιθανόλης ακολουθούμενες από φυγοκέντρηση και τέλος λυοφιλίωση του ιζήματος για την παραλαβή του πολυσακχαρίτη σε μορφή σκόνης.Για τη μελέτη της διαμόρφωσης του μορίου της κεφιράνης χρησιμοποιήθηκαν διάφορες τεχνικές όπως η τριχοειδής ιξωδομετρία, η χρωματογραφία αποκλεισμού μεγεθών με σκέδαση πολλαπλών γωνιών, η δυναμική σκέδαση φωτός και μετρήσεις ζ–δυναμικού, από όπου προέκυψε ότι τα μόρια του πολυσακχαρίτη σε υδατικό περιβάλλον φέρουν τη μορφή του περιδινούμενου κουβαριού (random coil) και το μέσο μοριακό τους βάρος είναι περίπου 7 x 105. Το νερό βρέθηκε να είναι «καλός» διαλύτης για την κεφιράνη, τα μόρια της οποίας φέρουν ελαφρώς αρνητικό φορτίο όταν βρίσκονται σε αυτό. Σύμφωνα με υδροδυναμικές μελέτες, η διαμόρφωση του μορίου της κεφιράνης επηρεάζεται ποικιλοτρόπως όταν βρίσκεται σε υδατικά περιβάλλοντα διαφορετικής ιονικής ισχύος, διαφορετικών τιμών pH, παρουσία οργανικών οξέων, σακχάρων, ουρίας και αιθανόλης. Η μελέτη της ρεολογικής συμπεριφοράς υδατικών διαλυμάτων κεφιράνης έδειξε ότι ο πολυσακχαρίτης παρουσιάζει ψευδοπλαστική συμπεριφορά. Δείγματα κεφιράνης συγκεντρώσεων από 1% έως 4%, στα οποία εφαρμόστηκε η διεργασία κατάψυξης-απόψυξης, παρουσίασαν μεγαλύτερες τιμές ιξώδους σε σχέση με τα αντίστοιχα δείγματα που δεν υπέστησαν την ίδια διαδικασία. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της λιπαινόμενης συμπιεστής ροής, σε συστήματα κεφιράνης όπου εφαρμόστηκε η διεργασία κατάψυξης-απόψυξης, το εκτατό ιξώδες επηρεάστηκε από τη συγκέντρωση του πολυσακχαρίτη όταν αυτή κυμαινόταν από 4% έως 7%, ενώ το δείγμα συγκέντρωσης 10% εμφάνισε τη συμπεριφορά μίας πραγματικής πηκτής. Από τη ρεολογική μελέτη συστημάτων κεφιράνης-πρωτεϊνών γάλακτος προέκυψε ότι η παρουσία του πολυσακχαρίτη δεν επηρέασε τις ιδιότητές τους. Η εξέταση με τη συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης με λέιζερ επιβεβαίωσε ότι η δομή αυτών των συστημάτων επηρεαζόταν κυρίως από την παρουσία των πρωτεϊνών και σε μικρότερο βαθμό από την παρουσία του πολυσακχαρίτη. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, τα συστήματα τροφίμων που περιέχουν κεφιράνη, και στα οποία έχει εφαρμοστεί η διεργασία κατάψυξης-απόψυξης, παρουσιάζουν πολύ σταθερή και συνεκτική δομή. Η κεφιράνη θα μπορούσε δυνητικά να χρησιμοποιηθεί σε τρόφιμα τα οποία υπόκεινται σε διεργασίες κατάψυξης-απόψυξης, ως ενισχυτικό υφής προσδίδοντας αποδεκτά προς τους καταναλωτές χαρακτηριστικά.