Πρωτεωμική προσέγγιση της λειτουργίας του σωματίου ματίσματος σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις - σύνδρομο Down

Abstract

In this thesis we studied the chorionic villi cultured cells. In the context of studying thesecells we established primary cell cultures from the original trophoblastic tissue andexamined the presence of mesenchymal cell populations with FACS. The cells ability todifferentiate, into osteogenic and neural lineages in particular, was also verified viadifferentiation experiments.The proteomic profile of chorionic villi cultured cells was studied by 2-dimensionalpolyacrylamide gel electrophoresis. Comparison of normal fetuses-derived chorionic villicultured cells proteomic profile and the proteins expressed in cells derived from fetuseswhere Down syndrome has been previously diagnosed with the use of cytogenetictechniques, revealed several proteins that were differentially expressed and couldtherefore be further examined for their potential use as markers/targets for thisaneuploidy. However, given that the spliceosome, that is located in the nucleus, and itsabberant isoforms, have been previously related to the syndrome’s phenotype,emphasis has been put on proteins expressed in that particular subcellular location.Splicing factor 3a2, found to be localized in the nuclear speckles by confocalmicroscopy, was found to be missing a possibly crucial for the unimpaired function ofthe spliceosome fraction of 5kDa in Down syndrome samples. Immunoprecipitationassays followed by 2DE analysis have not been fully able to reveal the broader pictureof the proteins affected by this abnormality, due to technique limitations; yet as in otherpregnancy-associated pathological conditions, gelsolin seems to be down regulated intrisomic cells.

Σε αυτή τη διατριβή αντικείμενο μελέτης αποτέλεσαν τα καλλιεργημένα κύτταρα χοριακών λαχνών. Στο πλαίσιο της μελέτης αυτών των κυττάρων δημιουργήθηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες από τον αρχικό ιστό του τροφοβλάστη και εξετάσθηκε η παρουσία σε αυτά μεσεγχυματικών πληθυσμών με κυτταρομετρία ροής, FACS. Η ικανότητά τους να διαφοροποιούνται, συγκεκριμένα σε οστεογενείς και νευρωνικές γενιές, επαληθεύθηκε με πειράματα διαφοροποίησης.Για τη μελέτη του πρωτεωμικού προφίλ των καλλιεργημένων κυττάρων χοριακών λαχνών χρησιμοποιήθηκε η δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση πολυακρυλαμιδίου. Η σύγκριση του πρωτεωμικού προφίλ των κυττάρων που προέρχονται από φυσιολογικές κυήσεις και κυήσεις με έμβρυα στα οποία διαγνώσθηκε σύνδρομο Down με κυτταρογενετικές τεχνικές, αποκάλυψε διάφορες πρωτεΐνες που εκφράζονται διαφορετικά στις δυο αυτές καταστάσεις και οι οποίες θα μπορούσαν να εξετασθούν περαιτέρω για την ενδεχόμενη χρήση τους ως δείκτες/στόχοι για τη συγκεκριμένη ανευπλοειδία. Ωστόσο, δεδομένου ότι το σωμάτιο ματίσματος, το οποίο εντοπίζεται στον πυρήνα, και οι μη φυσιολογικές ισομορφές του, είχαν στο παρελθόν συσχετισθεί με το φαινότυπο του συνδρόμου, δόθηκε έμφαση στις πρωτεΐνες που εκφράζονται σε αυτό το συγκεκριμένο υποκυτταρικό σωματίδιο. Ο παράγοντας ματίσματος 3a2, ο οποίος με ομοεστιακή μικροσκοπία βρέθηκε πως εντοπίζεται στα πυρηνικά στίγματα,βρέθηκε κατατετμημένος κατά ένα, πιθανώς σημαντικό για τη σωστή λειτουργία του σωματίου ματίσματος, θραύσμα 5kDa στα δείγματα με σύνδρομο Down. Οι μελέτες ανοσοκατακρήμνισης ακολουθούμενες από δισδιάστατη πρωτεωμική ανάλυση δεν έδωσαν ικανοποιητικά αποτελέσματα όσον αφορά στην απόδοση μιας ευρύτερης εικόνας των πρωτεϊνών που επηρεάζονται από αυτή τη μη φυσιολογική μορφή, λόγω περιορισμών της μεθόδου, ωστόσο φαίνεται πως, όπως και σε άλλες παθολογικές καταστάσεις της εγκυμοσύνης, στα παθολογικά με τρισωμία 21 κύτταρα καταστέλλεται η έκφραση της γελσολίνης.