Μελέτη του ρόλου των συστατικών του μεταβολικού μονοπατιού της HDL στην παθογένεια της οστεοπόρωσης και της οστεοαρθρίτιδας

Abstract

Introduction: Recent data suggest that lipid metabolism imbalances affect osteoblast function and therefore may result in the development of degenerative and metabolic diseases such as osteoporosis. Osteoporosis is a common metabolic disease, which is characterized by low bone mass and progressive micro-architectural deterioration of bone, resulting in bone fragility and fracture susceptibility. Knowing the very important role of HDL (High Density Lipoprotein) in plasma and tissue lipid metabolism, in the present thesis we aim to assess the role of Apolipoprotein A1 (APOA1), vital component of HDL biosynthesis in the regulation of bone cells function and in the pathogenesis of osteoporosis in mice.Materials and Methods: We used ApoA1 deficient (ApoA1-/-) and wild-type (ApoA1+/+, WT) mice. Two and seven days before euthanasia calcein was injected intraperitonealy for the determination of new bone formation rate. Before euthanasia blood plasma was obtained and then animals were sacrificed. Following sacrifice, lumbar vertebrae and femora were removed and were used for histological, histomorphometrical, biomechanical, spectrometric and in vitro analyses. More specifically, we performed classical H&E staining to evaluate the morphology of the tissue and cells that comprise the environment of bone. In addition, using microCT scanner and static histomorphometry we evaluated the quality/quantity of the cortical and cancellous bone. In the tissue sections we performed histological (Η&Ε) and histochemical (TRAP) analyses for the determination of bone resorption areas. Dynamic histomorphometry (calcein labeling) was employed for the determination of bone quality and bone cell function. Using RAMAN spectroscopy, the quality and biochemical composition of the collagen fibers of the examined femora were evaluated between the two animal groups. The biomechanical properties of the examined femora were evaluated using 3-point bending test. Osteoclast precursors and bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) were isolated, cultured and differentiated towards osteoclasts and osteoblasts/adipocytes, respectively. Using the different cell populations we assessed, in mRNA and protein level, the expression of osteoblastic (RUNX2, OSX, COL1A1), osteoclastic (OPG, RANKL, OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin Κ) and lipoblastic (PPARγ, CEBPA) regulators using Western Blotting, Flow Cytometry and qRT-PCR. Additionally, we evaluated the expression profile of genes associated with the cholesterol metabolic pathway (ApoA2, Ggps, Hmgcr, Hdlbp, Fdps1, Cpt1a, Scarb1) and genes which are involved in the maintenance and mobilization of MSC (Ptprc, Sca-1, Cxcl12, Cxcr4, Anxa2).Results: Bone mass was greatly reduced in ApoA1-/- mice relatively to wild type mice. ACTH was unaffected, though Scarb-1 mRNA in bone was greatly increased in ApoA1-/- mice. Static and dynamic histomorphometry showed that the reduced bone mass in ApoA1-/- mice, reflects decreased bone formation. Dynamic histomorphometry uncovered decreased osteoblast surface, bone formation and mineral apposition rate in ApoA1-/- mice. Notably, no changes were observed in osteoclast resorption areas. Biochemical composition and biomechanical properties of ApoA1-/- femora were impaired compared to the WT mice. Mesenchymal cell pool was similar between the two mouse groups. MSC differentiation from ApoA1-/- mice displayed significantly reduced osteoblasts, and increased adipocytes, relative to wild type, in identical differentiation conditions. This suggests a shift in MSC subtypes toward adipocyte precursors; increased adipocytes in ApoA1-/- mouse femora were consistent. Osteoclast differentiation in vitro and osteoclast surface in vivo were normal. In whole bone marrow cells, PPARγ was greatly increased, consistent with increased adipocytes and committed precursors. Furthermore, in the ApoA1-/- mice bone marrow, Cxcl12 mRNA level was decreased, while Cxcr4 mRNA level was increased, a finding consistent with reduced signaling in a pathway that supports MSC homing and osteoblast generation. In keeping, in the ApoA1-/- animals the osteoblast-related factors RUNX2, OSTERIX and COL1A1 were decreased. The ApoA1-/- phenotype also included increased CEPBa, furthermore supporting its lipoblastogenic effects.Conclusions: ApoA1 deficiency results in reduced bone mass, primarily due to reduced osteoblastic function. On the contrary ApoA1 deficiency results in increased adipogenesis and decreased osteoblastogenesis, resulting in impaired bone synthesis/quality, while osteoclast function remains unaffected. Our findings identify for the first time APOA1 as a key modulator of osteoblast and lipoblast function and raise the interesting possibility that APOA1 may be a potential therapeutic target for the treatment of osteoporosis and other metabolic diseases.

Εισαγωγή: Πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν ότι διαταραχές στον λιπιδικό μεταβολισμό επηρεάζουν τη λειτουργία των κυττάρων του οστού με αποτέλεσμα την ανάπτυξη εκφυλιστικών και μεταβολικών νόσων, όπως η οστεοπόρωση (ΟΠ). Η ΟΠ αποτελεί μια κοινή μεταβολική διαταραχή, η οποία χαρακτηρίζεται από μειωμένη οστική μάζα και σταδιακή επιδείνωση της μικροαρχιτεκτονικής δομής του οστίτη ιστού. Επακολούθως, οι ασθενείς που πάσχουν από τη νόσο διατρέχουν αυξημένο κίνδυνο καταγμάτων. Τα τελευταία χρόνια αρκετές μελέτες ανέδειξαν την ύπαρξη μιας ισχυρής σύνδεσης μεταξύ του οστικού και λιπιδικού μεταβολισμού. Επιπλέον, τόσο η ομάδα μας όσο και άλλοι ερευνητές έχουν δείξει ότι διαταραχές στο μεταβολισμό της υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης (High Density Lipoprotein-HDL) ενέχονται στην εμφάνιση μεταβολικών νοσημάτων, όπως είναι η Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ). Γνωρίζοντας τον πολύ σημαντικό ρόλο της HDL στον μεταβολισμό των λιπιδίων στο πλάσμα και στους ιστούς και οδηγούμενοι από τα ευρήματα της δικής μας ομάδας αλλά και άλλων ερευνητών, στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μελετήσαμε το ρόλο της απολιποπρωτεΐνης Α1 (APOA1), βασικού συστατικού του μονοπατιού βιοσύνθεσης της HDL, στη ρύθμιση της λειτουργίας των κυττάρων του οστού και στην παθογένεια της οστεοπόρωσης, σε πειραματικά μοντέλα ποντικών.Μεθοδολογία: Για τον λόγο αυτό, χρησιμοποιήσαμε μοντέλα ποντικών με έλλειψη του γονιδίου της ApoA1 (ApoΑ1-/-) και αγρίου τύπου (C57BL/6) (ομάδα ελέγχου). Δύο και επτά ημέρες προ της ευθανασίας πραγματοποιήθηκε ενδοπεριτοναϊκή ένεση καλσεΐνης. Πριν την ευθανασία λήφθηκε πλάσμα αίματος και ακολούθως τα ζώα θυσιάστηκαν. Από τα πειραματόζωα απομονώθηκαν χειρουργικά το μηριαίο οστό και οι οσφυϊκοί σπόνδυλοι, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για ιστολογικές, ιστομορφομετρικές, εμβιομηχανικές και in vitro αναλύσεις. Με τη χρήση microCT scanner εκτιμήθηκε η ποιότητα και η ποσότητα του σπογγώδους και του φλοιώδους οστού (στατική ιστομορφομετρία). Με τη χρώση TRAP και τη χρώση καλσεΐνης (δυναμική ιστομορφομετρία) ελέγχθηκε η οστική αποδόμηση και ο ρυθμός σύνθεσης νεοσχηματιζόμενου οστού, αντίστοιχα. Με τη χρήση φασματοσκοπίας Raman, αξιολογήθηκε η κατάσταση του δικτύου κολλαγόνου των μηριαίων οστών, ενώ αναλύθηκαν και οι εμβιομηχανικές ιδιότητες του οστού (αντοχή σε θραύση, ελαστικότητα κλπ) με τη χρήση του 3-point bending, στις δύο ομάδες πειραματόζωων. Επιπλέον, μεσεγχυματικά κύτταρα (MSC) του μυελού των οστών απομονώθηκαν από το μηριαίο οστό των πειραματόζωων και καλλιεργήθηκαν με σκοπό την εκτίμηση της έκφρασης, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, μορίων που εμπλέκονται στην οστεοβλαστική (RUNX2, OSX, COL1A1) και στην οστεοκλαστική λειτουργία (OPG, RANKL, OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin Κ) καθώς και στην λιπογένεση (PPARγ, CEBPA). Επίσης, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολικό μονοπάτι της χοληστερόλης (ApoA2, Ggps, Hmgcr, Hdlbp, Fdps1, Cpt1a, Scarb1), αλλά και των γονιδίων που σχετίζονται με τη διατήρηση και την κινητοποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων (Ptprc, Sca-1, Cxcl12, Cxcr4, Anxa2). Για την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών, χρησιμοποιήσαμε τις μοριακές τεχνικές Western Blot και κυτταρομετρία ροής ενώ για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA χρησιμοποιήσαμε τη real time RT-PCR. Αποτελέσματα: Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε στατιστικά σημαντική μείωση της οστικής μάζας στα ΑpoΑ1-/- συγκριτικά με τα ποντίκια αγρίου τύπου. Η έκφρασης της ACTH ήταν όμοια και στις δυο ομάδες ζώων, ενώ τα επίπεδα mRNA του Scarb1 ήταν σημαντικά αυξημένα στα ΑpoΑ1-/- ποντίκια. Τα αποτελέσματα της στατικής και δυναμικής ιστομορφομετρίας έδειξαν ότι η μειωμένη οστική μάζα στα ΑpoΑ1-/- ποντίκια αντικατοπτρίζει τη μειωμένη οστική σύνθεση. Η ανάλυση της βιοχημικής σύνθεσης και των εμβιομηχανικών ιδιοτήτων των μηριαίων οστών, έδειξε ότι αυτές οι παράμετροι ήταν διαταραγμένες στα ΑpoΑ1-/- συγκριτικά με τα αγρίου τύπου ποντίκια. Επιπρόσθετα, η επαγωγή διαφοροποίησης των MSC, κάτω από τις ίδιες συνθήκες, από τα ΑpoΑ1-/- ποντίκια φαίνεται να εμφανίζει μειωμένη παραγωγή οστεοβλαστών και αυξημένη παραγωγή λιποβλαστών σε αντίθεση με τα MSC από αγρίου τύπου ποντίκια. Αυτό φανερώνει την ύπαρξη μιας μετατόπισης στην ισορροπία της διαδικασίας διαφοροποίησης των MSC, η οποία ευνοεί την λιπογένεση. Η παρατήρηση αυτή έρχεται σε συμφωνία με την αρχική ιστολογική παρατήρηση της ύπαρξης αυξημένων λιποκυττάρων στο μυελό των οστών των ΑpoΑ1-/- ποντικιών σε σχέση με τα ποντίκια ελέγχου. Αντίθετα με τα ευρήματα για τη δυσλειτουργία των οστεοβλαστών, η οστεοκλαστική διαφοροποίηση in vitro και η μέτρηση της οστεοκλαστικής επιφάνειας in vivo εμφανίζονται ανεπηρέαστες. Επιπρόσθετα, σε ολικά κύτταρα του μυελού των οστών, σε συμφωνία με τα αυξημένα λιποκύτταρα και τα δεσμευμένα προς λιποβλάστες αρχέγονα MSC, τα επίπεδα έκφρασης του PPARγ είναι στατιστικώς σημαντικά αυξημένα στα ΑpoΑ1-/- ποντίκια. Ακόμα, στο μυελό των οστών στα apoΑ1-/- ποντίκια η έκφραση της κυτταροκίνης CXCL12 είναι μειωμένη, ενώ του CXCR4 αυξημένη, στοιχεία που συμφωνούν με μειωμένη σηματοδότηση στο μονοπάτι που εμπλέκεται στη διατήρηση των MSC (homing) και την οστεοβλαστική διαφοροποίηση. Επιπλέον, στα ApoΑ1-/- ποντίκια παρατηρείται σημαντική μείωση στους παράγοντες που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση και λειτουργία των οστεοβλαστών, όπως είναι ο RUNX2, ο OSX και ο COL1A1. Ενώ, επίσης τα knock out ποντίκια εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του παράγοντα CEPBa, υποδηλώνοντας την ύπαρξη πολύπλοκων αλλαγών στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση που απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση.Συμπεράσματα: Η έλλειψη της APOA1 οδηγεί σε ελάττωση της οστικής μάζας, κυρίως λόγω μειωμένης λειτουργίας των οστεοβλαστών. Επιπλέον, η έλλειψη της APOA1 οδηγεί σε αύξηση της λιπογένεσης και μείωση της οστεοβλαστογένεσης, η οποία με τη σειρά της οδηγεί σε ελαττωματική σύνθεση οστού, ενώ παράλληλα η δράση των οστεοκλαστών παραμένει ανεπηρέαστη. Τα αποτελέσματα μας, για πρώτη φορά, αναδεικνύουν ότι η APOA1 ρυθμίζει τη λειτουργία των οστεοβλαστών και των λιποβλαστών και αυξάνει την πιθανότητα ότι η APOA1 μπορεί να δράσει ως πιθανός θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης και άλλων μεταβολικών νοσημάτων.