Βελτιστοποίηση φιλικών προς το περιβάλλον διαδικασιών εκχύλισης για την παραλαβή βιοδραστικών προϊόντων

Abstract

Since the beginning of the 20th century, there has been a significant interest in the field of applied sciences. New and innovative technologies have been invented, leading to the significant improvement of the human life. But unfortunately, these achievements came with a cost. The chemical wastes, the toxic solvents, the byproducts and the production of greenhouse gasses had a significant impact on the environment the results of which are still visible till the present day. For this reason, the last century has been a systematic study for the replacement of the toxic solvents with new ones, environmentally friendly and less harmful such as supercritical fluid extraction, subcritical water extraction, accelerated solvent extraction, microwave assisted extraction and others, many of which have already found the way to the industrial applications. The subject of the present doctorat thesis was the study of optimization and the implementation of environmentally friendly extraction processes for the production of bioactive extracts from plants with significant pharmacological characteristics, using modern and innovative extraction technologies, such as supercritical CO2, accelerated solvent extraction and subcritical water extraction. For that, three different plant species were collected from different regions of Greece and were studied: Sideritis raeseri ssp. attica, Cistus creticus ssp. creticus and the roots of Glycyrrhiza glabra. The aim of this work was the application of the aforementioned techniques for the production of extracts that will exhibit: high yields, high antioxidant activity and significant phenolic and flavonoid content.The first plant was the aerial parts of Sideritis raeseri ssp. attica, a plant well known in Greece for its pharmacological activities, especially for its use in the treatment of colds and coughs. In order to extract the majority of the active metabolites, a sequential use of solvents is needed, such as: dichloromethane, methanol and water. The aim of this study was the substitution of these solvents with environmentally friendly ones like supercritical CO2, ethanol and water, without the decrease of the extract’s activity. This substitution led to extracts that exhibit higher yields, increased antioxidant activity and higher phenolic and flavonoid content only through the use of environmentally friendly procedures. Subsequently, the extract with the highest activity was subjected to further phytochemical analysis in order to isolate and characterize its major metabolites. The isolation led to the identification of lavandulofolioside, acteoside, hypolaetin 7-O-6΄΄΄-O-acetyl-β - D - allopyranosyl - (1→2) -β - D–glucopyranoside, leonoside A, isoscutellarein 7-O-6΄΄΄-O-acetyl- β-D- allopyranosyl-(1→2)-β-D- glucopyranoside and 4΄-Ο-methylhypolaetin 7-O-6΄΄΄-O-acetyl- β-D- allopyranosyl-(1→2)-β-D- glucopyranoside, from whom leonoside A was isolated for the first time from the Sideritis genus.The second plant studied in this dissertation was Cistus creticus ssp. creticus, an endemic species grown in Crete, well known for its unique aroma, pharmacological attributes and its ability to produce a resin called ‘ladano’. In this study, a comparison between supercritical fluid extraction and classic extractions (hydrodistillation and ultrasound assisted extraction both in plant and resin) took place.During this study, significant qualitative and quantitative differences were detected between the obtained extracts, the most important of which was the amount of manool oxide detected in the essential oils of hydrodistillation and supercritical extraction (14.4% and 2.57% respectively). As it turned out, these differences were directly related to the extraction procedures. The high temperatures and the elongated extraction times inside the Clevenger apparatus led to the production of the aforementioned terpenic metabolite through a thermal transformation-degradation of a relative compound, proving that the milder extracting conditions of the supercritical extraction provided higher quality extract, free of chemical alterations. In addition, the use of supercritical fluids led to the extraction of more active compounds such as 3β-hydroxy-13-epi-manoyl oxide and ribenol ethyl acetate that exhibit significant antimicrobial and antifungal activities enhancing even more the biological attributes of the engiven extract.Subsequently, a phytochemical analysis of the plant took place and the major bioactive metabolites contained in the most active extract were identified. The isolation concluded to the structural elucidation of 11 compounds: 4,5-di-epi-aristolochene, manool oxide, ent-13-epi-manoyl oxide, ent-3β-acetoxy-13-epi -manool oxide,ent-3β-hydroxy-13-epi-manool oxide (ribenol), apigenin 4’-methyl ether, quercetin 3,3΄-dimethyl ether, quercetin 3,4’-dimethyl ether, kaempferol 3-methyl ether, apigenin and quercetin 3-methyl ether.The last plant studied in this dissertation was the roots of Glycyrrhiza glabra, a plant with significant biological activities with a long history in folk medicine. The aim of this study was the optimization of supercritical fluid extraction in order to produce extracts with high yields, significant antioxidant activity, phenolic and flavonoid content, strong inhibitory activity against tyrosinase and high content of glabridin. For that purpose, Response Surface Methodology was applied. Initially, a series of screening experiments took place (via a 2 Level Factorial design) in order to find the significant parameters that affect the procedure and subsequently though a Central Composite Design to optimize them. The optimum conditions were finally identified by the use of numerical optimization which resulted in the production of two extracts: one with significant antioxidant activity (ABTS test) and one strong inhibitory activity in the tyrosinase enzyme (4.5 stronger than Kojic acid).Moreover, a theoretical approach was also studied thought the application of a mass balance model introduced by Sovová et al. (1994). As it was shown, the experimental data were satisfactorily correlated with the model, which in turn can be used to describe the procedure accurately.Finally, the residue of supercritical extraction was subjected to the Accelerated Solvent Extraction, in order to obtain the more polar compounds and produce extracts that exhibit high yields, significant antioxidant activity, high phenolic and flavonoid content. For that purpose, a case study was made by the use of Response Surface Methodology, which led to the production of extracts that show high extraction yields (32% on dry base) and high antioxidant potentials (ABTS IC50 = 27.50 and DPPH IC50 = 71.23).

Από τον προηγούμενο αιώνα μέχρι και σήμερα έχει σημειωθεί μία αλματώδης ανάπτυξη στον τομέα των θετικών επιστημών. Οι νέες και καινοτόμες τεχνολογίες που ήρθαν στο προσκήνιο, οδήγησαν στη σημαντική βελτίωση της ποιότητας της ανθρώπινης ζωής αλλά και στην αύξηση του προσδόκιμού της. Παρόλα αυτά, τα συγκεκριμένα επιτεύγματα δεν ήρθαν χωρίς κάποιο αντίτιμο. Η παραγωγή, η χρήση και η διάθεση των χημικών παραπροϊόντων της βιομηχανίας, είχε σε πολλές περιπτώσεις αρνητικές συνέπειες τόσο στην ανθρώπινη υγεία όσο και στο φυσικό περιβάλλον. Σε αυτό λοιπόν το πλαίσιο αναπτύχθηκε μια έντονη ερευνητική δραστηριότητα με σκοπό την αντικατάσταση των χρησιμοποιούμενων τοξικών διαλυτών με καινούργιους, φιλικούς προς το περιβάλλον. Το αποτέλεσμα αυτής της προσπάθειας οδήγησε στην εύρεση των ‘πράσινων’ και φιλικών προς το περιβάλλον τεχνικών εκχύλισης όπως τα υπερκρίσιμα ρευστά, η επιταχυνόμενη εκχύλισης, το υποκρίσιμο νερό και η εκχύλιση με μικροκύματα πολλές από τις οποίες έχουν ήδη βρει το δρόμο της βιομηχανικής εφαρμογής.Αντικείμενο της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η εφαρμογή, η μελέτη και η βελτιστοποίηση φιλικών προς το περιβάλλον διεργασιών εκχύλισης, για την παραγωγή δραστικών εκχυλισμάτων από φυτά με φαρμακολογική δράση, μέσα από τη χρήση σύγχρονων και καινοτόμων τεχνικών εκχύλισης όπως: η εκχύλιση με υπερκρίσιμο διοξείδιο του άνθρακα, η επιταχυνόμενη εκχύλιση και η εκχύλιση με υποκρίσιμο νερό. Για τη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν φυτά της Ελλάδας, γνωστά για τη φαρμακευτική τους δράση όπως ο Sideritis raeseri ssp. attica, η ρητίνη του φυτού Cistus creticus ssp. creticus και τα υπέργεια τμήματά του, καθώς και οι ρίζες του φυτού Glycyrrhiza glabra. Στόχος, ήταν η εφαρμογή των παραπάνω τεχνικών εκχύλισης για την παραγωγή δραστικών εκχυλισμάτων με υψηλές αποδόσεις, αυξημένο φορτίο σε φαινόλες και φλαβονοειδή και υψηλή αντιοξειδωτική δράση. Για την παραλαβή ολόκληρου του φάσματος των δευτερογενών μεταβολιτών μιας δρόγης απαιτείται η χρήση διαλυτών διαφορετικής πολικότητας. Συγκεκριμένα, μία συνήθης εφαρμογή διαλυτών κλιμακούμενης πολικότητας, η οποία είναι ικανή να παραλάβει ολόκληρο το φάσμα των βιοδραστικών συστατικών, περιλαμβάνει αρχικά τη χρήση διχλωρομεθανίου για την παραλαβή των άπολων συστατικών του φυτού, στη συνέχεια χρήση μεθανόλης, για τα μέσης πολικότητας συστατικά και τέλος χρήση νερού. Τα πρώτο φυτό που μελετήθηκε στην παρούσα διατριβή ήταν το είδος S. raeseri ssp. attica στο οποίο έγινε η μελέτη ενός πρωτοκόλλου εκχύλισης, με σκοπό την αντικατάσταση των προαναφερθέντων, οργανικών διαλυτών (διχλωμομεθανίου και μεθανόλης), με διαλύτες φιλικούς προς το περιβάλλον (υπερκρίσιμο CO2 και αιθανόλη) για την παραλαβή εκχυλισμάτων με υψηλές αποδόσεις και υψηλή βιολογική δράση. Συγκεκριμένα, θεσπίσθηκε ένα πρωτόκολλο εκχύλισης το οποίο περιλάμβανε αρχικά, την χρήση υπερκρίσιμου διοξειδίου του άνθρακα (με προσθήκη συνδιαλύτη) σε διάφορες συνθήκες (για την εκχύλιση των μη πολικών συστατικών του φυτού) και στην συνέχεια εισαγωγή του υπολείμματος στην συσκευή επιταχυνόμενης εκχύλισης (ASE) και εκχύλιση με αιθανόλη και νερό για την παραλαβή των πιο πολικών συστατικών. Τα εκχυλίσματα τα οποία προέκυψαν από τη διεργασία δεν ήταν μόνο απαλλαγμένα από οργανικούς διαλύτες, αλλά αποδείχτηκαν δραστικότερα, συγκρινόμενα με αυτά της συμβατικής μεθόδου, διαθέτοντας υψηλότερο φορτίο σε φαινόλες και υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση.Τέλος, το εκχύλισμα που παρουσίασε την καλύτερη αντιοξειδωτική δράση και το υψηλότερο φορτίο σε φαινολικά συστατικά, υποβλήθηκε σε φυτοχημική μελέτη για την απομόνωση των κύριων μεταβολιτών του. Ταυτοποιήθηκαν έξι μεταβολίτες: ο λαβαντουλιφολιοσίδης, ο ακτεοσίδης, ο 7-O-6΄΄΄-O-ακετυλο-β - D - αλλοπυρανοσυλο - (1→2) -β - D -γλυκοπυρανοσίδης της υπολετίνης, ο λεονοσίδης Α, ο 7-O-6΄΄΄-O-ακετυλο- β-D- αλλοπυρανοσυλο -(1→2)-β-D- γλυκοπυρανοσίδης της ισοσκουτελαρεΐνης και ο 7-O-6΄΄΄-O-ακετυλο- β-D- αλλοπυρανοσυλο -(1→2)-β-D- γλυκοπυρανοσίδης της 4΄-Ο-μεθυλοϋπολετίνης, εκ τον οποίων ο λεονοσίδης Α απομονώνεται για πρώτη φορά από το γένος Sideritis.Όσον αφορά το είδος Cistus creticus, έγινε μελέτη της διεργασίας της υπερκρίσιμης εκχύλισης για την παραλαβή των μη πολικών συστατικών της ρητίνης του φυτού (λάδανο) και των υπέργειων τμημάτων του, καθώς και η σύγκριση αυτών με κλασσικές τεχνικές εκχύλισης, όπως η υδροαπόσταξη και η εκχύλιση με υπερήχους. Από τη μελέτη των εκχυλισμάτων και των αιθέριων ελαίων που παρασκευάσθηκαν, παρατηρήθηκαν σημαντικές ποιοτικές και ποσοτικές διαφορές, οι οποίες σχετίζονται με την διαδικασία εκχύλισης. Σημαντικότερη εξ αυτών αποτέλεσε η διαφορά στη συγκέντρωση του μεταβολίτη οξειδίου της μανοόλης, όπου για το αιθέριο έλαιο της υδραπόσταξης υπολογίσθηκε στα 14.4% ενώ για την υπερκρίσιμη εκχύλιση στο 2.57% Φαίνεται ότι οι υψηλές θερμοκρασίες και οι εκτεταμένοι χρόνοι εκχύλισης εντός της συσκευής Clevenger οδηγούν στη θερμική αλλοίωση/μετατροπή ορισμένων συστατικών τα οποία με τη σειρά τους οδήγησαν στην υψηλή συγκέντρωση του μεταβολίτη, αποδεικνύοντας με αυτόν τον τρόπο ότι οι ηπιότερες συνθήκες της υπερκρίσιμης εκχύλισης αποτρέπουν τον θερμικό καταβολισμό, οδηγώντας στην παραλαβή ποιοτικά ανώτερων εκχυλισμάτων με αναλλοίωτα συστατικά.Επιπλέον, το αιθέριο έλαιο το οποίο παρασκευάσθηκε από τη διεργασία της υπερκρίσιμης εκχύλισης διαθέτει πιο φυσικό άρωμα το οποίο θυμίζει περισσότερο του φρέσκου φυτού, διότι μέσα από την εφαρμογή μιας headspace ανάλυσης, αποδείχθηκε ότι το αιθέριο έλαιο αυτής περιέχει συστατικά, τα ποσοστά των οποίων παρουσιάζουν περισσότερα κοινά στοιχεία με αυτά της πηγής προέλευσης. Επιπλέον, το αιθέριο έλαιο της διεργασίας είναι και ποιοτικά ανώτερο διότι, λόγω των πολύ καλών εκχυλιστικών ιδιοτήτων της μεθόδου, συνεκχυλίζονται και άλλα, πιο βαριά δραστικά συστατικά τα οποία διαθέτουν σημαντικές αντιμικροβιακές ιδιότητες (εντ-3β-υδροξυ-13-επι-οξείδιο της μανοόλης και ο οξικός εστέρας της ριμπενόλης), προσδίδοντας στο λαμβανόμενο αιθέριο έλαιο βιολογική μεγαλύτερη αξία. Τέλος, σε επιλεγμένα εκχυλίσματα της υπερκρίσιμης εκχύλισης, τα οποία ήταν πλούσια σε βιοδραστικούς δευτερογενείς μεταβολίτες, πραγματοποιήθηκε φυτοχημική μελέτη για την απομόνωση των κυριότερων μεταβολιτών τους από όπου ταυτοποιήθηκαν: το 4,5-δι-έπι αριστολοχένιο, το εντ-οξείδιο της μανοόλης, το εντ-13-επι-οξείδιο της μανοόλης, το εντ-3β-ακετοξυ-13-επι-οξείδιο της μανοόλης (οξικός εστέρα της ριμπενόλης), το εντ-3β-υδροξυ-13-επι-οξείδιο της μανοόλης (ριμπενόλη), ο 4’-μεθυλαιθέρας της απιγενίνης (ακακετίνη), ο 3,3΄-διμεθυλαιθέρας της κερκετίνης, ο 3,4’-διμεθυλαιθέρας της κερκετίνης, ο 3-μεθυλαιθέρας της καιμπφερόλης, η απιγενίνη και ο 3-μεθυλαιθέρας της κερκετίνης.Το τελευταίο φυτό το οποίο μελετήθηκε στην παρούσα εργασία ήταν οι ρίζες του φυτού G. glabra. Σκοπός της μελέτης αποτέλεσε η εφαρμογή και η βελτιστοποίηση της διεργασίας της υπερκρίσιμης εκχύλισης για την παραγωγή εκχυλισμάτων με σημαντικές αντιοξειδωτικές δράσεις, φορτίο σε φαινόλες και φλαβονοειδή, υψηλή συγκέντρωση γκλαμπριντίνης και ισχυρή ανασταλτική δράση έναντι του ενζύμου της τυροσινάσης. Για την επίτευξη του στόχου αυτού έγινε η εφαρμογή της Μεθοδολογίας Επιφάνειας Απόκρισης (Response Surface Methodology), όπου αρχικά έγινε η χρήση ενός Factorial σχεδιασμού 2 επιπέδων (2-level Factorial design), για την εύρεση των σημαντικών παραμέτρων της διεργασίας και στη συνέχεια ενός Central Composite σχεδιασμού για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών της εκχύλισης. Στη συνέχεια, εφαρμόζοντας έναν αλγόριθμο αριθμητικής βελτιστοποίησης, προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες παραλαβής εκχυλισμάτων από όπου και παρασκευάσθηκαν δύο εκχυλίσματα: ενός με υψηλή αντιοξειδωτική δράση στο ABTS (όμοια με αυτή του Trolox: IC50≈8 μg/mL), καθώς και ενός με ισχυρή λευκαντική δράση, η οποία είναι 4.5 φορές πιο ισχυρή από αυτή του πρότυπου αναστολέα (Kojic acid: IC50≈1.34 μg/mL).Η παραπάνω μελέτη δε θα μπορούσε να θεωρηθεί ολοκληρωμένη αν δεν γινόταν και μια θεωρητική μελέτη αυτής μέσα από την εφαρμογή ενός μοντέλου πρόρρησης. Η περιγραφή έγινε με τη χρήση ενός μοντέλου εμβολικής ροής που προτάθηκε από τους των Sovová et al. (1994), το οποίο κατάφερε να περιγράψει πολύ καλά τα πειραματικά δεδομένα, ενώ ταυτόχρονα βοήθησε και στον υπολογισμό των συντελεστών μεταφοράς μάζας.Τέλος, έλαβε χώρα και η μελέτη του υπολείμματος της υπερκρίσιμης εκχύλισης. Ένα υλικό το οποίο, αν και απαλλαγμένο από τα μη πολικά συστατικά, εξακολουθεί να είναι πλούσιο σε πολικούς μεταβολίτες, οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρασκευή εκχυλισμάτων με αξιόλογες βιολογικές δράσεις. Γι’ αυτό το λόγο, έγινε μία προσπάθεια αξιοποίησής του για την παρασκευή εκχυλισμάτων τα οποία θα χαρακτηρίζονται από καλή αντιοξειδωτική δράση και υψηλό φορτίο σε φαινόλες και φλαβονοειδή στη συσκευή της επιταχυνόμενης εκχύλισης. Και σε αυτή την περίπτωση επιλέχθηκε να γίνει μια μελέτη βελτιστοποίησης της εκχυλιστικής διεργασίας. Λόγω των πολύ καλών αποτελεσμάτων της Μεθοδολογίας Επιφάνειας Απόκρισης, έγινε η εφαρμογή ενός Central Composite σχεδιασμού, για τη βελτιστοποίηση της διεργασίας, κάνοντας χρήση διαλυτών, φιλικών προς το περιβάλλον όπως αιθανόλης/νερού και υποκρίσιμου νερού, από όπου και προέκυψαν εκχυλίσματα με αξιόλογες βιολογικές δράσεις και ιδιαίτερα υψηλές αποδόσεις οι οποίες αγγίζουν το 32% του ξηρού βάρους της δρόγης.