Μοριακοί μηχανισμοί ανταπόκρισης στη χημειοθεραπεία με πλατίνη: μελέτη σε ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών

Abstract

Introduction: Ovarian cancer is the fourth cause of death among all gynecologic cancers. Although platinum drugs have produced higher overall response rates and an increase in median survival, a relevant clinical problem in the treatment of advanced ovarian cancer is the development of tumor resistance to platinum compounds. The mechanism of platinum resistance is multifactorial, but DNA repair plays the most important role.Purpose: One of the objectives of this thesis was to investigate the repair of DNA damage induced by platinum drugs. Although our previous data showed that the levels of DNA damage may serve as a biomarker predictive of patient therapeutic response, the assays used for the measurement of gene specific DNA repair are fairly time-consuming, and require complex procedures such as Southern transfer and hybridization. Therefore, we developed three different methods, multiplex Q-PCR, alkaline comet assay and induction of gammaH2Ax, which are rapid and convenient methodologies of wider applicability and suitable for application in a clinical context. The second goal was the investigation of the molecular pathways which are induced after the formation of these adducts. The ultimate aim of this study was to develop and validate an appropriate molecular biomarker for prediction of patient response to chemotherapy with platinum drugs. Materials and Methods: Platinum-induced DNA damage formation/repair was measured in HepG2 cells and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 9 healthy volunteers and 18 patients with ovarian cancer, using Southern blot analysis and quantitative PCR assay. Then, using immunocytochemistry, we investigated the induction of key components of the DNA damage response pathway, such as gammaH2Ax, ATR, ATM, Chk1 and Chk2, after treatment of HepG2 cells with platinum drugs. Results: Using HepG2 cells, we found the appropriate conditions to measure DNA damage. The adduct levels measured by Q-PCR were very similar to the levels of total DNA adducts measured by Southern blot analysis, suggesting that Q-PCR measures cisplatin-induced total adducts. Another observation is that cisplatin-induced intrastrand cross-link levels reached a plateau within ~3h of treatment, while peak interstrand cross-links were observed at ~24h.Carboplatin induced maximal levels of both intra- and interstrand cross-links were observed within 24h of drug incubation. In the second part of our report, we investigated ATM-ATR pathways after exposure to platinum drugs. Using immunocytochemistry, gammaH2Ax was rapidly activated, followed by the sequential induction of the ATR and ATM pathways, after treatment of HepG2 cells with platinum drugs. Finally, using multiplex Q-PCR, alkaline comet assay and gammaH2Ax staining, we measured the DNA damage in the ex vivo platinum-treated lymphocytes of 9 healthy volunteers and 18 patients with ovarian cancer. Application of the alkaline comet assay showed that significantly greater DNA damage was found in the group of patients sensitive to subsequent chemotherapy compared to resistant ones [13927,42 Olive Tail Moment for sensitive and 7834,25 for resistant, p=0.05]. Also, using immunocytochemistry, we examined the induction of gammaH2Ax and found very similar results to those obtained using alkaline comet assay (p=0,058). Moreover, patients with ovarian cancer showed greater endogenous DNA damage than healthy volunteers (p=0,01). Finally, using immunocytochemistry, we found that healthy volunteers had more panuclear stained cells than patients, indicating that because the latters had suppressed the apoptotic pathway (p=0,01). Conclusion: In the present study, we focused on the molecular mechanisms of DNA damage response pathways (gammaH2Ax, ATR, ATM, Chk1 and Chk2) and the possible implications in the malignant transformation of the disease and the outcome of platinum-based chemotherapy. We found that changes in the DNA repair efficiency as measured in PBMCs from ovarian cancer patients are implicated in both the malignant transformation of the disease and the clinical response to platinum chemotherapy. These data might eventually be translated into novel indicators for the early detection of the disease and the selection of patients who are more likely to benefit from platinum chemotherapy.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Ο καρκίνος των ωοθηκών αποτελεί την τέταρτη αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των γυναικών. Με την χρήση των πλατινούχων παραγόντων στη χημειοθεραπεία του καρκίνου αυτού παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στα ποσοστά πενταετούς και συνολικής επιβίωσης, χωρίς, όμως, να επιτυγχάνεται ίαση της νόσου. Μία από τις βασικές αιτίες της τελικής αποτυχίας είναι η ανάπτυξη αντοχής στα φάρμακα αυτά. Πολλές ερευνητικές εργασίες έχουν δείξει ότι οι μηχανισμοί αντοχής είναι πολυπαραγοντικοί, με την επιδιόρθωση των βλαβών του DNA να συμβάλλει σε σημαντικό ποσοστό. ΣΤΟΧΟΙ: Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της βλάβης που προκαλείται στο DNA από πλατινούχους παράγοντες και η διερεύνηση των μοριακών μονοπατιών που επάγονται μετά την αναγνώριση της βλάβης από το κύτταρο. Με δεδομένη τη σημασία της επιδιόρθωσης στην επιβίωση του καρκινικού κυττάρου και ως εκ τούτου στην ανταπόκριση του ασθενούς στη χημειοθεραπεία καθώς και το γεγονός ότι οι μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται μέχρι στιγμής για τον προσδιορισμό της δεν μπορούν εύκολα να χρησιμοποιηθούν στη κλινική πρακτική, αναπτύξαμε κατ΄αρχήν τρεις καινούργιες ευαίσθητες μεθοδολογίες (ποσοτική PCR, η αλκαλική μέθοδος δημιουργίας κομητών, μέτρηση της επαγωγής γH2AX με τη βοήθεια του ανοσοφθορισμού και της συνεστιακής μικροσκοπίας), που δίνουν αξιόπιστα αποτελέσματα σε σύντομο χρονικό διάστημα. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Το πειραματικό μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε ήταν η ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2 και απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος από υγιείς εθελοντές και ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών. Στα κύτταρα αυτά μετά την ex vivo χορήγηση πλατινούχων παραγόντων (σισπλατίνης, καρβοπλατίνης) μελετήθηκε το είδος των βλαβών στο DNA που προκαλούνται από τους παράγoντες αυτούς και η κινητική σχηματισμού/επιδιόρθωσης των βλαβών χρησιμοποιώντας ανάλυση κατά Southern και ποσοτικό PCR. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας τεχνικές ανοσοφθορισμού και συνεστιακής μικροσκοπίας έγινε διερεύνηση των μορίων (γΗ2ΑΧ, ΑΤΜ, ΑΤR, Chk1, Chk2) που επάγονται μετά την αναγνώριση της βλάβης από το κύτταρο. Τέλος, εφαρμόζοντας τις μεθοδολογίες, που αναπτύξαμε, μετρήθηκαν τα επίπεδα βλάβης/επιδιόρθωσης του DNA ή/και των ενδιαμέσων της επιδιόρθωσης της βλάβης. Τέλος, έγινε πιστοποίηση των τριών μεθοδολογιών σε επίπεδο βιολογικών δειγμάτων (απομονωμένα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος) που ελήφθησαν από 9 υγιείς δότες και 18 ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών πριν τη χορήγηση χημειοθεραπείας και τα αποτελέσματα συσχετίσθηκαν με την κλινική απόκριση των ασθενών στη χημειοθεραπεία. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Χρησιμοποιώντας την ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2, σε κάθε μέθοδο ξεχωριστά επιλέχθηκαν οι κατάλληλες συνθήκες που εξασφαλίζουν την ποσοτικοποίηση της σχέσης δόσεις πλατίνης-επιπέδων της επαγόμενης βλάβης του DNA. Σε πρώτη φάση, διερευνήθηκε το είδος των βλαβών της πλατίνης που ανιχνεύεται με τη μέθοδο του ποσοτικού PCR και η κινητική σχηματισμού τους χρησιμοποιώντας ως μέθοδο ελέγχου την ανάλυση κατά Southern. Μετά από σύγκριση των επιπέδων βλαβών που μετρώνται με τη ποσοτική PCR με εκείνα που ανιχνεύονται με την ανάλυση κατά Southern στα ίδια δείγματα, βρέθηκε ότι η μέθοδος της ποσοτικής PCR μετράει το σύνολο των βλαβών που δημιουργούνται από τα παράγωγα της πλατίνης. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα των ολικών βλαβών που προκαλούνται από τη σισπλατίνη φτάνουν σε πλατό μέσα στις 3 πρώτες ώρες χορήγησης, ενώ οι σταυροδεσμοί αυξάνονται συναρτήσει του χρόνου παρουσιάζοντας μέγιστη τιμή στις 24 ώρες. Αντιθέτως, στην περίπτωση της καρβοπλατίνης οι ολικές βλάβες καθώς και οι σταυροδεσμοί αυξάνονται συναρτήσει του χρόνου παρουσιάζοντας μέγιστη τιμή στις 24 ώρες. Με τη βοήθεια του ανοσοφθορισμού και της συνεστιακής μικροσκοπίας αποδείχθηκε ότι η γH2Ax είναι το πρώτο μόριο που επάγεται, στη συνεχεία, ενεργοποιείται το μονοπάτι ATR - Chk1 και ακολούθως το μονοπάτι ATM - Chk2. Χρησιμοποιώντας την αλκαλική μέθοδο δημιουργίας κομητών βρήκαμε ότι οι βλάβες που δημιουργούνται από τη καρβοπλατίνη στα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος των ασθενών που ανταποκρίθηκαν στη χημειοθεραπεία είναι στατιστικά σημαντικά υψηλότερες από εκείνες των ασθενών που δεν ανταποκρίθηκαν (p=0,05). Συγκεκριμένα, ο μέσος όρος Olive Tail Moment (OTM, αυθαίρετες μονάδες που αποτελούν μέτρο του επιπέδου βλαβών του DNA), που μετρήθηκε στους ευαίσθητους ασθενείς βρέθηκε 13927,42 ενώ στους ανθεκτικούς ήταν 7834,25. Χρησιμοποιώντας το προσδιορισμό επαγωγής γH2AX με τη βοήθεια του ανοσοφθορισμού και της συνεστιακής μικροσκοπίας οι μετρήσεις οδήγησαν στα ίδια ακριβώς συμπεράσματα όπως και στην αλκαλική μέθοδο δημιουργίας κομητών με στατιστική σημαντικότητα (p=0,03). Συγκεκριμένα, μετρώντας τα επίπεδα επιδιορθωτικής ικανότητας μεταξύ των ασθενών, όπως αυτά εκφράζονται με τη μέτρηση του εμβαδού της περιοχής κάτω από την καμπύλη [(% ποσοστό με >5 εστίες γH2AX) x δόση], βρέθηκε ότι ευαίσθητοι ασθενείς εμφανίζουν τιμή 15765,83, ενώ οι ανθεκτικοί 12846,66. Επίσης, και με τις δύο μεθοδολογίες διαπιστώθηκε ότι οι ενδογενείς βλάβες των υγιών δοτών είναι στατιστικά σημαντικά χαμηλότερες σε σχέση με τους ασθενείς (p<0,001). Τέλος, μια άλλη παρατήρηση ήταν ότι οι υγιείς δότες επάγουν χρώση όλου του πυρήνα του κυττάρου (panuclear, αποτελεί μέτρο της αποπτωτικής διαδικασίας) σε μικρότερο ποσοστό σε σχέση με τους ασθενείς που σημαίνει ότι οι τελευταίοι εμφανίζουν μικρότερη ικανότητα επαγωγής της αποπτωτικής διαδικασίας (p=0,01), ένα βιολογικό χαρακτηριστικό που μπορεί να επηρεάσει το αποτέλεσμα της χημειοθεραπείας. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Στη παρούσα διατριβή διαπιστώθηκε η επαγωγή των μορίων που εμπλέκονται στα κυτταρικά μονοπάτια αναγνώρισης της βλάβης από τη πλατίνη και μεταγωγής του σήματος (γH2AX, ATR, Chk1, ATM, Chk2). Ακόμα αποδείχτηκε ότι η επιδιόρθωση των βλαβών DNA αποτελεί σημαντικό παράγοντα που συμβάλλει στο αποτέλεσμα της χημειοθεραπείας με παράγωγα πλατίνης. Στη συνέχεια βρέθηκε ότι οι αλλαγές στην ικανότητα επιδιόρθωσης των καρκινικών κυττάρων αντικατοπτρίζεται στα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος (ιστός δείκτης) κάτι που σημαίνει ότι η μέτρηση βλάβης/επιδιόρθωσης σε λεμφοκύτταρα μπορεί να αποτελέσει μοριακό δείκτη πρόγνωσης του θεραπευτικού αποτελέσματος. Τέλος, χρησιμοποιώντας την αλκαλική μέθοδο δημιουργίας κομητών και τη μέτρηση των επιπέδων του γH2AX με ανοσοφθορισμό βρήκαμε ότι οι ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών παρουσιάζουν μεγαλύτερο αριθμό ενδογενών γονοτοξικών βλαβών από τους υγιείς δότες (κάτι που πιθανά συμβάλλει στην εξέλιξη της νόσου) και από την άλλη μπορέσαμε να αναγνωρίσουμε τα άτομα που θα ωφεληθούν από τη μετέπειτα χορήγηση της χημειοθεραπείας. Τα αποτελέσματα της μελέτης μπορούν να αξιοποιηθούν στην ανάπτυξη ευαίσθητων μοριακών δεικτών για τη έγκαιρη διάγνωση της ασθένειας και τη πρόγνωση της κλινικής απόκρισης των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών στη χημειοθεραπεία με παράγοντες πλατίνης.