Μεθυλίωση και απενεργοποίηση των γονιδίων RASSF1A και RAR-β2 στην καρκινογένεση του μαστού

Abstract

Background: Promoter hypermethylation is common in Breast Cancer (BC) with studies mainly in histological specimens showing frequent methylation of tumor suppressor genes (TSGs) compared with normal tissues. The aim of this study was to estimate the frequency of promoter methylation of RAR-β2 & RASSF1A genes in breast FNAB material aiming to evaluate the methylation status of these two genes as biomarker for detecting BC in Greek population. Methods: FNAB material from 104 patients was collected for cytological evaluation and epigenetic analysis. DNA was extracted and subjected to bisulfite conversion. Amethylation-specific PCR was carried out and the final products were separated with electrophoresis in 2% agarose gels. Results: From 104 samples, RASSF1A hypermethylation was observed in 78 (75%) and RARβ2 hypermethylation in 64 (61.6%). 84% and 78% of the C5 cases (n=50) were methylated for RASSF1A and RAR-β2 respectively. Methylated RASSF1A and RAR-β2 were also detected in 88.3% and 76.5% in C4 samples (n=17) and in 57.2% of C3 samples (n=14). The Odds Ratio for breast malignancy was 4.545 in patients with RASSF1A hypermethylation and 9.167 in patients with RAR-β2 hypermethylation underlying their promoter’s methylation positive correlation with breast malignancy. Conclusion: To optimize the sensitivity and specificity of this epigenetic setting, more TSGs related to BC should be gradually imported in our evaluated methylation panel and bevalidated in a larger study sample with the aim that the obtained epigenetic profiles from patients will provide clinicians with valuable tools for management of BC patients in Greece.

Υπόβαθρο: Η DNA υπερμεθυλίωση γονιδιακών υποκινητών είναι αρκετά συχνό φαινόμενο στον Καρκίνο του Μαστού, με τις περισσότερες μελέτες μέχρι σήμερα που βασίζονται σε ιστολογικό υλικό από βιοψίες μαστού να καταδεικνύουν συχνή μεθυλίωση σε ογκοκατασταλτικά γονίδια σε κακοήθεις ιστούς σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς. Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν ο προσδιορισμός της συχνότητάς μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων RAR-β2 & RASSF1A σε κυτταρολογικό υλικό από FNAB μαστού με σκοπό να διερευνηθεί εάν η κατάσταση μεθυλίωσης αυτών των 2 γονιδίων μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιοδεικτής για την ανίχνευση περιστατικών κακοήθειας μαστού σε ελληνικό πληθυσμό. Μεθοδολογία: Σε υλικό FNAB μαστού από 104 ασθενείς πραγματοποιήθηκε κυτταρολογική εξέταση και επιγενετική ανάλυση μεθυλίωσης. DNA απομονώθηκε από τα κλινικά δείγματα και υφίστατο τροποποίηση παρουσία όξινου θειώδους νατρίου (bisulfite conversion). Σχεδιάστηκε και εφαρμόστηκε ένα ειδικό πρωτόκολλο methylation-specific PCR (MSP) και τα τελικά MSP προϊόνταδια χωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 2% πηκτώματα αγαρόζης. Αποτελέσματα: RASSF1A υπερμεθυλίωση παρατηρήθηκε σε 78 (75%) και RAR-β2 υπερμεθυλίωση σε 64 (61,6%) από τα συνολικά 104 περιστατικά. 84% και 78% από τα περιστατικά C5 (n=50) ήταν μεθυλιωμένα στα γονίδια RASSF1A και RAR-β2 αντιστοίχως. Μεθυλίωση στα γονίδια RASSF1A και RAR-β2 ανιχνεύτηκε επίσης σε 88,3% και 76,5% στα περιστατικά C4 (n=17) και σε 57,2% των περιστατικών C3 (n=14). Ο σχετικός κίνδυνος για κακοήθεια μαστού ήταν 4,545 σε ασθενείς με υπερμεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίουRASSF1A και 9,167 σε ασθενείς με υπερμεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου RAR-β2 υποδηλώνοντας τη θετική συσχέτιση των 2 αυτών μεθυλιωμένων δεικτών με την εμφάνιση κακοήθειας μαστού. Συμπέρασμα: Για τη βελτιστοποίηση της ευαισθησίας και ειδικότητας του διγονιδιακού πάνελ μεθυλίωσης που διερευνάται στα πλαίσια αυτής της διατριβής, απαιτείται εμπλουτισμός του με περισσότερα σχετιζόμενα με τον καρκίνο του μαστού ογκοκατασταλτικά γονίδια και αξιολόγηση του σε μεγαλύτερο δείγμα μελέτης με σκοπό τα επιγενετικά δεδομένα μεθυλίωσης που θα συγκεντρωθούν από τις αναρροφήσεις FNAB μαστού να παρέχουν στους κλινικούς ιατρούς πολύτιμα εργαλεία στην διαχείριση περιστατικών κακοήθειας μαστού στην Ελλάδα.