Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδου LC-MS για τον προσδιορισμό υπολειμμάτων αντιβιοτικών και μεταβολιτών τους σε ψάρια

Abstract

This thesis describes the development and validation of methods for the determinationof sulfadiazine (SDZ), trimethoprim (TMP), and acetyl-sulfadiazine (AcSDZ), the mainmetabolite of SDZ, with dapsone as internal standard, in tissues of cultured fish, likemuscle plus skin in natural proportion, liver and serum. In Greece, both SDZ and TMPare approved drugs for use in aquaculture. They are usually used in a ratio SDZ:TMP of5:1, for the promotion of growth and for prophylactic and therapeutic purposes mainlyagainst bacteria diseases.The wide use of antibiotics in aquaculture results in the presence of drug residues infish tissues, that can have undesirable effects on consumer health. LiquidChromatography-Mass Spectrometry with high sensitivity and selectivity was used forthe detection and quantitation of residues in concentrations below the MaximumResidue Limits (MRLs) which have been set by the European Union. The levels belowMRLs are considered to be safe on consumer health. The MRL for the sum ofsulfonamides has been set to 100 μg kg-1 and for TMP 50 μg kg-1 in muscle plus skin.Analysis was performed by using High Performance-Liquid Chromatographic systemand the analytical column XTerra MS C18 (100,0´2,1 mm, 3,5 μm) kept at 40 oC. Themobile phase was consisted of water and acetonitrile, both solvents containing formicacid 0,05 % (v/v), and was pumped at a programme of gradient elution and a constantflow rate of 0,2 mL min-1. The detection of analytes and internal standard wasperformed by using the Mass Spectrometric system model ZQ 2000, monitoring thepositive (protonated) ions of the drugs.Extraction of drugs from muscle plus skin and liver samples was carried out by usingwater in Accelerated Solvent Extraction. Abselut Nexus 60 mg /3 mL Solid PhaseExtraction cartridges were used for sample cleanup. Liquid-liquid extraction with ethylacetate and cleanup with n–hexane were used for serum sample preparation.The methods were validated according to the 2002/657/EC European Decision andwere used for the determination of SDZ, TMP and AcSDZ in tissues of gilthead seabream after a two diet trial. Withdrawal times (Wts) of the drugs were calculated byWT1.4 software

Σε αυτή τη διατριβή πραγματοποιήθηκε η ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδων για τονπροσδιορισμό της σουλφαδιαζίνης (SDZ) και της τριμεθοπρίμης (TMP), καθώς και τουκύριου μεταβολίτη της σουλφαδιαζίνης, της ακετυλο-σουλφαδιαζίνης (AcSDZ), μεεσωτερικό πρότυπο τη δαπσόνη (DPS), σε ιστούς καλλιεργούμενων ιχθύων, όπως ησάρκα με δέρμα σε φυσική αναλογία, το ήπαρ και ο ορός. Οι δραστικές ουσίες SDZ καιTMP είναι εγκεκριμένες στην Ελλάδα για χρήση τους στις ιχθυοκαλλιέργειες.Χρησιμοποιούνται συνήθως, σε αναλογία SDZ:TMP 5:1, τόσο για λόγους προώθησηςτης ανάπτυξης, όσο και για λόγους προφύλαξης και θεραπείας έναντι πολλώνβακτηριακών, κυρίως, νοσημάτων.Η ευρεία χρήση των αντιβιοτικών οδηγεί στην παρουσία καταλοίπων στους ιστούς τωνιχθύων, με αποτέλεσμα να προκύπτουν κίνδυνοι για την υγεία των καταναλωτών. Έτσι,στις μεθόδους που αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν, χρησιμοποιήθηκε η τεχνικήΥγροχρωματογραφίας-Φασματομετρίας μαζών (Liquid Chromatography-MassSpectrometry, LC/MS), η οποία με την υψηλή ευαισθησία και την εκλεκτικότητα πουέχει, επιτρέπει την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των ουσιών σεσυγκεντρώσεις πολύ χαμηλότερες από τα Ανώτατα Όρια Καταλοίπων (MaximumResidue Limits, MRLs) που έχει θέσει η Ευρωπαϊκή Ένωση (E.E.). Η παρουσία τωνουσιών σε συγκεντρώσεις κάτω από τα MRLs θεωρείται «ασφαλής» για την υγεία τωνκαταναλωτών. Το MRL για το σύνολο των σουλφοναμιδίων (SAs) είναι 100 μg kg-1 καιγια την TMP 50 μg kg-1 σάρκας με δέρμα.Για τον χρωματογραφικό διαχωρισμό των αναλυτών και του εσωτερικού προτύπουχρησιμοποιήθηκε Υγροχρωματογραφικό Σύστημα Υψηλής Απόδοσης με αναλυτικήστήλη XTerra MS C18 (100,0´2,1 mm, 3,5 μm), θερμοστατούμενη στους 40 oC.Εφαρμόστηκε πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης στην κινητή φάση, η οποία αποτελείτοαπό ύδωρ και ακετονιτρίλιο με μυρμηκικό οξύ 0,05 % (v/v) και είχε ροή 0,2 mL min-1. Ωςανιχνευτής χρησιμοποιήθηκε το φασματόμετρο μαζών, μοντέλο ZQ 2000, επιλέγονταςτη μέτρηση θετικών (πρωτονιωμένων) ιόντων των υπό μελέτη ουσιών. Για την κατεργασία των δειγμάτων σάρκας με δέρμα και ήπατος χρησιμοποιήθηκε τοΣύστημα Επιταχυνόμενης Εκχύλισης, με το ύδωρ ως διαλύτη εκχύλισης, ο δεκαθαρισμός έγινε με χρήση των στηλών Εκχύλισης Στερεάς Φάσης Abselut Nexus 60mg /3 mL. Για την κατεργασία των δειγμάτων ορού πραγματοποιήθηκε Yγρό-υγρόEκχύλιση με οξικό αιθυλεστέρα και περαιτέρω καθαρισμός με n-εξάνιο.Οι μέθοδοι επικυρώθηκαν σύμφωνα με την Απόφαση 2002/657/ΕΚ της ΕυρωπαϊκήςΚοινότητας και χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης των SDZ,TMP και AcSDZ στους ιστούς τσιπούρας, μετά από βιολογικό πειραματισμό με δύοδιαφορετικές τροφές. Τέλος, υπολογίστηκε ο χρόνος αποδρομής των (Withdrawal time,Wt), στις δύο περιπτώσεις, με το στατιστικό πρόγραμμα WT1.4.