Σύνθεση αντικαρκινικών παραγόντων με πιθανή βιολογική δράση στο σηματοδοτικό μονοπάτι του Hedgehog

Abstract

The present thesis describes the syntheses of analogs of Taepeenin D (Tae D), suitable for structure activity relationship studies (SARS). Tae D is a cassane-type diterpenoid which was initially isolated from Caesalpinia crista and was latter found to inhibit Hh/Gli mediated transcription at a micromolar concentration, as a component of Acacia pennata. Moreover, Tae D exhibts selective cytotoxicity in cancer cell lines while it is proved non-toxic to normal cells. On the other hand, the Hedgehog (Hh) pathway is among the most ipmortant signaling pathways involved in stem cells (SCs) and cancer stem cells (CSCs) being a key regulator of embryonic patterning, cellular proliferation, and differentiation. However, its aberrant activation in adults has been linked to several types of tumors, while futher studies had showed that it plays a crucial role in the self-renewal of these cells. Two key targets for activation/deactivation of this pathway are a) the signal transduction and consequently its activation through the SMO protein (upstream) and b) the involvement of Gli agents at the end of the pathway (downstream) for the transcription of Hh genes, which are responsible for the development of cancers in adults. Therefore, molecules that are capable of inhibiting the Hh pathway are valuable tools for investigating stem cell biology as well as new anticancer therapeutic approaches.Given that Tae D is reported to effectively inhibit the Hh pathway downstream and the fact that abietic acid is a promising chiral template for the semi-synthesis of 14-desmethyl-Tae D analogs we thought of interest to synthesize a small library of such molecules suitable for SARS. Thus, starting from readily available abietic acid we synthesized the Tae D analogs bearing modifications in one or more parts of the parent molecule (see areas A, B, C and D). Specifically, the modifications made, involved: a) the quandary center C-4 (area Α) by replacement of the -COOH group with carboxylic acid derivatives such as esters and amides or by its reduction to the corresponding -OH group b) the replacement of the chiral -OH group at the C-6 position (area Β) either by hydrogen or by its esterification and c) modifications of the D area by reduction of the double bond, the introduction of substituents to the furan ring, as well as by replacement of the later with other heterocyclic structures, such as oxazoles and isoxazoles.Several of these analogs (24 out of 40) have been evaluated (by a collaborating group) for their ability to block SAG-induced Hh pathway activation in a cell-based Gli–luciferase reporter gene assay (SAG/Shh-LIGHTII assay). This led to the discovery of six new hit compounds with IC50 < 15 μΜ, two thereof are considered to be lead compounds with IC50 = 0.74 μΜ and IC50 = 0.64 μΜ, since they showed higher inhibition activity than cyclopamine itself (IC50 = 5 μΜ, used as control).

Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται η σύνθεση αναλόγων της Ταεπεενίνης D (Tae D), κατάλληλων για μελέτες συσχετισμού δομής-βιολογικής δράσης (SARS). Η Tae D είναι ένα διτερπένιο κασσανικού τύπου το οποίο απομονώθηκε από το φυτό Caesalpinia crista. Η σημασία του μορίου έγκειται στο ότι αναστέλλει σημαντικά τη δράση του βιολογικού μονοπατιού Hedgehog (Hh) ακόμη και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις, δηλ. της τάξης των μM υποδεικνύοντας εκλεκτική τοξικότητα έναντι των καρκινικών κυττάρων. Το Hh μονοπάτι είναι ένα βιολογικό μονοπάτι το οποίο εμπλέκεται στην ανάπτυξη των βλαστικών κυττάρων και η μη φυσιολογική ενεργοποίησή του στους ενήλικες έχει συνδεθεί με την εμφάνιση διαφόρων ειδών καρκίνου, ενώ πρόσφατα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην αυτο-ανανέωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων. Βασικά σημεία του μονοπατιού αποτελούν α) η ενεργοποίησή του μέσω της SMO πρωτεΐνης και κατά συνέπεια η μεταγωγή σήματος από αυτή και β) η εμπλοκή των Gli παραγόντων στο τέλος του μονοπατιού για τη μεταγραφή των Hh γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την εμφάνιση καρκίνων στους ενήλικες. Συνεπώς, μόρια τα οποία είναι ικανά να αναστέλλουν το Hh μονοπάτι αποτελούν πολύτιμα εργαλεία για τη διερεύνηση της βιολογίας των βλαστικών κυττάρων αλλά και για νέες αντικαρκινικές θεραπευτικές προσεγγίσεις.Με δεδομένο ότι η Tae D δείχνει να αναστέλλει το Hh μονοπάτι στο τελικό στάδιο και το γεγονός ότι το αβιετικό οξύ αποτελεί ένα δελεαστικό χειρόμορφο εκμαγείο για την ημισύνθεση αναλόγων της (εφόσον περιλαμβάνει στο σκελετό του τρία από τα τέσσερα χειρόμορφα κέντρα της) θεωρήσαμε σημαντικό να προβούμε στη σύνθεση τέτοιων μορίων κατάλληλων για SARS. Έτσι λοιπόν ξεκινώντας από εμπορικά διαθέσιμο αβιετικό οξύ, συντέθηκαν ανάλογα που φέρουν τροποποιήσεις σε μια ή/και περισσότερες από τις περιοχές A, B, C και D. Συγκεκριμένα οι τροποποιήσεις αφορούν: α) στο τεταρτοταγές κέντρο C-4 (περιοχή Α) δηλ. με αντικατάσταση της καρβοξυλομάδας από παράγωγά της όπως εστέρες, αμίδια ή με αναγωγή της προς την αντίστοιχη υδροξυλομάδα β) αντικατάσταση της ασύμμετρης υδροξυλομάδας στη θέση C-6 (περιοχή Β) είτε από υδρογόνο με ταυτόχρονη απώλεια του ασύμμετρου κέντρου είτε με εστεροποίησή της και γ) τροποποιήσεις στην περιοχή D τόσο με αναγωγή του διπλού δεσμού, την εισαγωγή υποκαταστατών στο φουρανικό δακτύλιο, αλλά και την αντικατάστασή του με άλλες ετεροκυκλικές δομές, όπως π.χ. τα οξαζόλια και ισοξαζόλια.Ένα μεγάλο μέρος των αναλόγων (24 από 40) έχουν ήδη αξιολογηθεί βιολογικά από ομάδα συνεργατών αναδεικνύοντας έξι βιοδραστικά μόρια με IC50 < 15 μΜ. Αξίζει να σημειωθεί τα δύο από αυτά αποτελούν ενώσεις οδηγούς (lead compounds) με IC50 = 0.74 μΜ και IC50 = 0.64 μΜ αφού εμφανίζουν ισχυρότερη αναστολή της μεταγραφής των Hh γονιδίων σε πειράματα SAG/Shh-LIGHTII ακόμη και από την ίδια την κυκλωπαμίνη (IC50 = 5 μΜ, ένωση αναφοράς).