Διερεύνηση μεταλλάξεων του μιτοχονδριακού DNA σε πρωτοπαθή μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα

Abstract

Mitochondria play an important role in both apoptosis and haem synthesis. Given the appreciation of their significant contribution to maintain cellular homeostasis it is not surprising that mitochondrial mutations are associated with a variety of both congenital diseases (Pearson’s syndrome) as well as acquired ones such as various cancers.Due to their significant contribution to the regulation of haem synthesis and apoptosis, we were interested in investigating the role of mitochondrial DNA mutations in Myelodysplastic syndromes in which iron laden mitochondria are associated with variable cytopenias and apoptosis of hematopoietic cells and correlate the findings with clinical characteristics as well as to the level of apoptosis.Our analysis included 55 cases of de novo MDS (38 male, 17 female) with a median age 71.5 (43-87). In 29/55 cases apoptosis was calculated by flow cytometry on freshly isolated total bone marrow mononuclear cells as well as on CD34+ cells. Early apoptotic cells were classified as Annexin V + cells and late apoptotic as Annexin V+/PI + cells.Of the 55 cases, 47 were analyzed for mitochondrial cytochrome c-oxidase I and II gene mutations using PCR amplification and direct sequencing analysis. Bone marrow cells from 13 patients with lymphoma without bone marrow involvement were used as controls.RESULTS No statistically significant difference was found between early and late apoptosis of total cells and CD34+ cells in patients with MDS and normal controls. No statistically significant association was detected between all these parameters and FAB, WHO and IPSS classifications. However, a significant higher median value of CD34+ late apoptotic cells was found in cases with ≥ 5% bone marrow blast percentage. Moreover, the median percentage value of late apoptosis was significantly higher in total bone marrow mononuclear cells compared to CD34+ cells. The analysis of Cytochrome C I and II gene mutations detected 3/47 cases with mutations: One case with RAEB-II and Intermediate-II IPSS was characterized by a silent T to C change at nt position 7374 of cytochrome C-oxidase I gene, a second case with RARS and intermediate-I IPSS had a C to T change at nt 7868 of cytochrome C-oxidase II gene resulting in Leu to Phe substitution and a case with RAEB-I and Intermediate-I IPSS had a silent C to T change at nt 7875 of the same gene.CONCLUSIONS In our series, cases with blast percentage ≥ 5% were characterized by significantly higher numbers of late apoptotic CD34+ cells. Late apoptosis is significantly higher in total mature bone marrow cells compared to primitive CD34+ cells. Cytochrome C oxidase I and II gene mutations were not a frequent phenomenon, detected in 6.4 % of cases. It is interesting to note that 1/3 cases with RARS was characterized by a cytochrome C-oxidase II gene mutation resulting in aminoacid substitution, stressing the importance of these mutations in this MDS subtype.

Τα μιτοχόνδρια διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο τόσο στην απόπτωση, όσο και στη σύνθεση της αίμης. Λόγω της σημαντικής συμβολής τους στη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης, δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι μιτοχονδριακές μεταλλάξεις σχετίζονται με διάφορα συγγενή ( σύνδρομο Pearson ) και επίκτητα νοσήματα ( νεοπλασίες ).Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η ανίχνευση του ρόλου των μεταλλάξεων του μιτοχονδριακού DNA σε πρωτοπαθή μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα στα οποία τα μιτοχόνδρια σχετίζονται με διαφόρου βαθμού κυτταροπενίες και απόπτωση των αιμοποιητικών κυττάρων και η συσχέτιση των αποτελεσμάτων αυτών με διάφορα κλινικά χαρακτηριστικά, καθώς και με το βαθμό της απόπτωσης.Η μελέτη μας συμπεριέλαβε 55 ασθενείς με πρωτοπαθές ΜΔΣ ( 38 άρρενες και 17 γυναίκες ασθενείς ) με διάμεση τιμή ηλικίας τα 71.5 έτη. Σε 29 από τους 55 ασθενείς υπολογίσθηκε η απόπτωση με κυτταρομετρία ροής τόσο σε ολικά κύτταρα μυελού των οστών ( μονοκύτταρα ), όσο και στα CD34+ κύτταρα. Τα πρώιμα αποπτωτικά κύτταρα προσδιορίσθηκαν ως Αννεξίνη+ κύτταρα και τα όψιμα αποπτωτικά κύτταρα προσδιορίσθηκαν ως Αννεξίνη+/PI+ κύτταρα.Σε 47 από τους 55 ασθενείς χρησιμοποιήθηκε μυελός των οστών για ανίχνευση μεταλλάξεων των γονιδίων των κυτοχρωμικών οξειδασών Ι και ΙΙ . Η μελέτη των μεταλλάξεων πραγματοποιήθηκε με PCR και sequencing.Κύτταρα μυελού των οστών από 13 ασθενείς με λέμφωμα χωρίς διήθηση του μυελού από νεοπλασματικά κύτταρα, χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρας ( normal control ). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Δεν διαπιστώθηκαν σημαντικά στατιστικές διαφορές όσον αφορά την πρώιμη και την όψιμη απόπτωση τόσο στα ολικά , όσο και στα CD34+ κύτταρα σε ασθενείς με ΜΔΣ και στην ομάδα των μαρτύρων ( normal controls ). Δεν διαπιστώθηκαν σημαντικά στατιστικές διαφορές όσον αφορά την πρώιμη και την όψιμη απόπτωση τόσο στα ολικά , όσο και στα CD34+ κύτταρα σε σχέση με παραμέτρους όπως οι ταξινομήσεις FAB , WHO και το IPSS score. Διαπιστώθηκε σημαντικά αυξημένη διάμεση τιμή CD34+ όψιμων αποπτωτικών κυττάρων σε ασθενείς με ποσοστό βλαστών ≥ 5%. Επιπρόσθετα διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση στην όψιμη απόπτωση των ολικών κυττάρων σε σχέση με τα CD34+ κύτταρα. Από τους 47 ασθενείς με ΜΔΣ, σε τρεις ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις των γονιδίων της οξειδάσης Ι και ΙΙ. Μία μετάλλαξη αφορούσε το γονίδιο της οξειδάσης Ι στη νουκλεοτιδική θέση 7374 με αντικατάσταση της θυμίνης από κυτοσίνη. Όσον αφορά το γονίδιο της οξειδάσης ΙΙ του κυτοχρώματος ανιχνεύθηκαν οι ακόλουθες μεταλλάξεις : 1) αντικατάσταση της κυτοσίνης από θυμίνη στη νουκλεοτιδική θέση 7868 με αποτέλεσμα αμινοξική αλλαγή ( αλλαγή της λευκίνης από φαινυλαλανίνη) και 2) αντικατάσταση της κυτοσίνης από θυμίνη στη νουκλεοτιδική θέση 7875. Αξίζει να σημειωθεί ότι από τις παραπάνω μεταλλάξεις που ανιχνεύθηκαν, οι δύο περιγράφονται για πρώτη φορά σε ασθενείς με ΜΔΣ. Χρειάζονται περισσότερες μελέτες, με μεγαλύτερο αριθμό ασθενών για να διαπιστωθεί η βιολογική σημασία των μεταλλάξεων του μιτοχονδριακού DNA και η σχέση τους με τους μηχανισμούς της απόπτωσης στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα.