Μελέτη της επίδρασης του ιονοφόρου ασβεστίου και αυξητικού παράγοντα σε ανθρώπινα ωάρια και ανθρώπινα έμβρυα προεμφυτευτικού σταδίου

Abstract

Purpose Artificial oocyte activation using calcium ionophores and enhancement of embryonic developmental potential by the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) have already been reported. In this study, we evaluated the synergistic effect of these two methods on aged human unfertilized oocytes after intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Then, we cultured the resulting embryos to the blastocyst stage and screened them for chromosomal abnormalities, to assess the safety of this protocol.Methods Aged human oocytes deemed unfertilized after ICSI were activated, either by briefly applying the calcium ionophore A23187 alone (group A) or by briefly applying the ionophore and then supplementing the culture medium with recombinant human GM-CSF (rhGM-CSF) (group B). Next, embryo development was monitored in a time-lapse incubator system, and ploidy was analyzed by array comparative genomic hybridization (aCGH), after whole embryo biopsy and whole genome amplification. Differences between oocytes and resulting embryos in both groups were evaluated statistically.Results Oocytes unfertilized after ICSI can be activated with the calcium ionophore A23187 to show two pronuclei and two polar bodies. Addition of rhGM-CSF in the culture medium of A23187-activated oocytes enhances their cleaving and blastulation potential and results in more euploid blastocysts compared to the culture medium alone.Conclusions The exposure of human unfertilized oocytes 18 h after ICSI to a combination of calcium ionophore A23187 and the GM-CSF cytokine can safely salvage the oocytes, resulting in the development of good-morphology, euploid blastocysts, with potential clinical use.

Σκοπός: Η ενεργοποίηση ωαρίων με τη βοήθεια ιονοφόρων διαύλων ασβεστίου και η ενίσχυση του αναπτυξιακού δυναμικού των εμβρύων με τον αυξητικό παράγοντα GM-CSF είναι γνωστές. Στην παρούσα μελέτη αξιολογήθηκε η συνεργιστική επίδραση της εφαρμογής των δύο αυτών μεθόδων σε μη γονιμοποιημένα ωάρια ανθρώπου έπειτα από μικρογονιμοποίηση (ICSI). Στη συνέχεια, τα έμβρυα καλλιεργήθηκαν μέχρι το στάδιο της βλαστοκύστης, και εξετάσθηκαν για πιθανές χρωμοσωματικές ανωμαλίες, προκειμένου να προσδιοριστεί η ασφάλεια του πρωτοκόλλου.Μέθοδοι: Ωάρια που δεν είχαν γονιμοποιηθεί 18 h μετά την ICSI υπέστησαν ενεργοποίηση, είτε με βραχυχρόνια εφαρμογή του ιονοφόρου ασβεστίου A23187 (ομάδα A) είτε με βραχυχρόνια εφαρμογή το ιονοφόρου ασβεστίου A23187 και επακόλουθη προσθήκη ανασυνδυασμένου ανθρώπινου GM-CSF (ομάδα B). Η ανάπτυξη των εμβρύων παρατηρήθηκε σε επωαστικό κλίβανο εφοδιασμένο με σύστημα μικροφωτογράφισης με χρονοδιολίσθηση και η πλοειδία τους αναλύθηκε με συγκριτικό γονιδιωματικό υβριδισμό σε μικροσυστοιχίες DNA (aCGH), έπειτα από ολική βιοψία και ενίσχυση του ολικού γονιδιώματος. Οι διαφορές μεταξύ των ωαρίων και των εμβρύων στις δύο ομάδες εκτιμήθηκαν στατιστικά.Αποτελέσματα: Ωοκύτταρα που δεν γονιμοποιήθηκαν έπειτα από ICSI είναι δυνατόν να ενεργοποιηθούν με τη χρήση ιονοφόρου ασβεστίου A23187 και να εμφανίσουν δύο προπυρήνες και δύο πολικά σωμάτια. Η προσθήκη rhGM-CSF στο καλλιεργητικό μέσον ενισχύει το δυναμικό αυλάκωσης και δημιουργίας βλαστοκύστεων, οδηγώντας στην ανάπτυξη περισσότερων ευπλοειδών βλαστοκύστεων σε σύγκριση με καλλιεργητικό μέσον χωρίς προσθήκη αυξητικού παράγοντα.Συμπεράσματα: Η έκθεση ανθρώπινων μη γονιμοποιημένων ωαρίων 18 h μετά την ICSI σε συνδυασμό ιονοφόρου ασβεστίου A23187 και κυτταροκίνη GM-CSF είναι δυνατόν να διασώσει τα ωάρια και να οδηγήσει στην ανάπτυξη ευπλοειδών βλαστοκύστεων καλής μορφολογίας, δυνητικά χρήσιμες για κλινική εφαρμογή.