Προσδιορισμός της μορφής του γονιδιώματος του στελέχους HPV-16: συσχέτιση με την κλινική εικόνα του ασθενή και προσδιορισμός της θέσης ενσωμάτωσης του ιού στο κυτταρικό γονιδίωμα

Abstract

Human Papillomaviruses (HPVs) are non enveloped, epitheliotropic, double stranded, circular DNA viruses that infect cutaneous and/or mucosal epithelia. Over 150 different HPV types have been characterized, and approximately 40 of them are detected in the cervical epithelia and are classified as members of the genus Alphapapillomavirus. Epidemiological studies have revealed that persistent infection with high-risk human papillomavirus is the main risk factor for the development of high grade precancerous lesions and cervical carcinoma, with HPV16 and HPV18 types being the most frequently identified HPV types in invasive cervical cancer cases worldwide. Cancer progression is associated with persistent high-risk HPV infection and with deregulated expression of viral oncogenes E6 and E7. The E6 and E7 oncoproteins mediate mitogenic and antiapoptotic stimuli by interacting with numerous regulatory proteins of the host cell that control the cell cycle. As a consequence, HPV infection causes excessive cell proliferation, deficient DNA repair, and the accumulation of genetic damages in the infected cell.Persistent infection with high-risk ΗPV types is associated with an increasing risk of genome integration into the host cell chromosome and progression to cancer. Viral integration deregulates the expression of the E6 and E7 proteins in the high-risk HPVs types. As a consequence, the virus stimulates cell cycle entry, providing selective growth advantage to the infected cells. In addition, the extensive proliferation of the infected epithelial cells is directly responsible for the accumulation of genetic errors, and genome destabilization that result in cancer development.The present thesis, focused on the molecular analysis of HPV16 DNA. Moreover, the HPV16 DNA physical state and the HPV16 integration sites into the cellular chromosome were determined. The study was carried out in HPV16 positive cervical samples derived from Greek population, that were diagnosed as high grade, low grade squamous intraepithelial lesions and cervical cancer cases. Nucleotide and phylogenetic analysis of HPV16 DNA, showed that the prototype stain and the European variant are both prevalent in Greek population, while non European variants are circulating among Greek women. To the best of our knowledge, novel sequence variations were reported for the first time within Ε1, Ε2, Ε4, Ε6 and Ε7 genes, as well as duplications and intratypic recombination events among distinct ΗPV16 variants were also reported. However, molecular evolutionary analysis proposed that different genes at the early region of ΗPV16 genome are dominated by different selective pressure and that might be associated with the essential role of viral proteins in the productive viral life cycle.In addition, the present thesis studied the physical state of HPV16 DNA, considering that the key importance for the progression of cervical intraepithelial neoplasias (CIN) to invasive cervical cancer is the integration of HPV into the host genome. The physical state of viral genome was determined, taking into consideration the most frequently disrupted sites of HPV16 DNA, revealing that the viral integration is an early event in the viral life cycle. Finally, according to integration sites analysis, rearrangements within HPV16 genome were determined. In particular, a model of looping was proposed by which viral - host DNA concatatemers - mediate replication and recombination resulting to rearrangements in inverted orientation. According to this hypothesis, after HPV16 integration into the host chromososome, the virus promotes genome destabilization leading to cancer development. In conclusion, the extensive mapping analysis of disruption sites of E1 and E2 genes, in combination with the nucleotide analysis of E1, E2 and E6 genes, and the detection of HPV16 genome rearrangements, is a prerequisite in order to further understand and analyze the physical state of HPV16 DNA form in cancer progression.

Οι Ιοί των Θηλωμάτων του ανθρώπου (HPV) είναι μικροί, δίκλωνοι κυκλικοί DNA ιοί, χωρίς εξωτερικό περίβλημα και προσβάλουν το επιθήλιο του δέρματος ή το επιθήλιο του βλεννογόνου. Περισσότεροι από 150 HPV τύποι έχουν ανιχνευτεί, ενώ πάνω από 40 τύποι συνδέονται με αλλοιώσεις του ουρογεννητικού συστήματος και διαχωρίζονται στους τύπους χαμηλού (low-risk) και υψηλού κινδύνου (high-risk). Επιδημιολογικές μελέτες έχουν προτείνει ότι ''επίμονη'' μόλυνση με HPV τύπους υψηλού κινδύνου, είναι σημαντικός παράγοντας για την ανάπτυξη προκαρκινικών και καρκινικών αλλοιώσεων με τους HPV16 και HPV18 να εντοπίζονται σε περισσότερο από το 72% των περιπτώσεων καρκίνου του τραχήλου της μήτρας παγκοσμίως. Η εμφάνιση καρκίνου συνδέεται με μόλυνση με HPV τύπους υψηλού κινδύνου και με την απορύθμιση της έκφρασης των ιικών ογκογονιδίων Ε6 και Ε7. Η ανεξέλεγκτη έκφραση των ογκογονιδίων οδηγεί στον εκτεταμένο πολλαπλασιασμό των μολυσμένων κυττάρων, στην ατελή επιδιόρθωση του DNA και στη συσσώρευση μεταλλάξεων στα μολυσμένα κύτταρα.Η ''επίμονη'' υψηλού βαθμού αλλοίωση συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο ενσωμάτωσης του ιού στο κυτταρικό χρωμόσωμα και την πρόοδο της αλλοίωσης σε καρκίνο. Η ενσωμάτωση του ιού στο κυτταρικό γονιδίωμα αποσταθεροποιεί την έκφραση των γονιδίων Ε6 και Ε7. Το γεγονός αυτό δίνει την δυνατότητα στον ιό να διεγείρει έντονα τον κυτταρικό κύκλο και την διαρκή είσοδο του κυττάρου στη φάση της μίτωσης, δίνοντας στα μολυσμένα κύτταρα ισχυρό αναπτυξιακό πλεονέκτημα. Σε δεύτερη φάση μετά τον συνεχή πολλαπλασιασμό των μολυσμένων κυττάρων προκαλείται συσσώρευση γενετικών λαθών και αποσταθεροποίηση του γονιδιώματος του ξενιστή με αποτέλεσμα την δημιουργία καρκινικών αλλοιώσεων.Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του γονιδιώματος του HPV16, ενώ παράλληλα επιχειρήθηκε ο προσδιορισμός της μορφής του γονιδιώματος του ιού και ο προσδιορισμός των θέσεων ενσωμάτωσης του HPV16 στο κυτταρικό χρωμόσωμα.. Η μελέτη______________________________________________________________________ΕΚΤ | www.didaktorika.gr | 5πραγματοποιήθηκε σε κλινικά δείγματα τραχήλου της μήτρας που απομονώθηκαν από τον Ελληνικό πληθυσμό, θετικά για μόλυνση με τον ιό. Η νουκλεοτιδική και φυλογενετική ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι το πρότυπο στέλεχος του HPV16 καθώς και η Ευρωπαϊκή παραλλαγή του γονιδιώματος του ιού επικρατούν στον Ελληνικό πληθυσμό, ενώ παράλληλα παρατηρήθηκε ότι μη Ευρωπαϊκές παραλλαγές του HPV16 DNA κυκλοφορούν στον Ελληνικό πληθυσμό. Ακόμη εντοπίστηκαν καινούργιες μεταλλάξεις εντός των γονιδίων Ε1, Ε2, Ε4, Ε6 και Ε7 που δεν έχουν αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία καθώς επίσης και φαινόμενα διπλασιασμού και ενδοτυπικού ανασυνδυασμού μεταξύ διαφορετικών παραλλαγών του HPV16 DNA. Τέλος, οι διαφορετικές περιοχές της πρώιμης περιοχής του γονιδιώματος του HPV16 DNA εξελίσσονται με διαφορετικό τρόπο και αυτό ίσως να σχετίζεται με τις διαφορετικές λειτουργίες που επιτελούν οι ιικές πρωτεΐνες στο κύκλο ζωής του ιού.Παράλληλα, προσδιορίστηκε η μορφή του HPV16 DNA, χαρτογραφώντας τις πιο συχνές θέσεις ρήξης του ιικού DNA. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε, ότι η ενσωμάτωση του HPV16 είναι ένα φαινόμενο το οποίο συμβαίνει νωρίς στο κύκλο ζωής του ιού. Τέλος, από τον προσδιορισμό των θέσεων ενσωμάτωσης του ιού στο κυτταρικό χρωμόσωμα εντοπίστηκαν φαινόμενα αναδιάταξης του HPV16 DNA προτείνοντας ένα μοντέλο, σύμφωνα με το οποίο ενσωματωμένα μόρια DNA σε μορφή αλυσομερών HPV16 DNΑ - κυτταρικό DNA έρχονται σε αντιπαράλληλο προσανατολισμό και ανασυνδυάζονται μεταξύ τους μέσω μιας δομής θηλιάς. Το φαινόμενο αυτό προκαλεί διαρκώς αποσταθεροποίηση του κυτταρικού χρωμοσώματος, γεγονός που δηλώνει, ότι ακόμη και μετά την ενσωμάτωση του ιού στο κυτταρικό χρωμόσωμα ο ιός συνεχίζει να προκαλεί διαρκώς φαινόμενα αποσταθεροποίησης του κυτταρικού DNA. Συμπερασματικά, η χαρτογράφηση των συνηθέστερων θέσεων ρήξης των Ε1 και Ε2 γονιδίων σε συνδυασμό με τη νουκλεοτιδική ανάλυση των γονιδίων Ε1, Ε2 και Ε6 του HPV16 και τον προσδιορισμό γεγονότων αναδιάταξης του HPV16 DNA θα πρέπει να λαμβάνεται σοβαρά υπόψη για τον προσδιορισμό της μορφής του γονιδιώματος των διαφορετικών HPV16 στελεχών και της περαιτέρω κατανόησης των γεγονότων τα οποίο εμπλέκουν τον HPV16 στην ογκογένεση.