Construction of microbial platform for the production of thermophilic enzymes implicated in lignocellulose degradation

Abstract

Cellulose, the most abundant polysaccharide on Earth, is a remarkable pure organic polymericcomponent of plant material, consisting solely of 1,4-linked β-D-glucopyranose units held together in agiant straight chain molecule. In nature, a variety of microorganisms are known for producing a set ofenzymes, referred to as cellulases, that are capable of degrading this insoluble polymer to solublesugars, primarily cellobiose and glucose. The application and interest in cellulases has particularlyincreased in recent years with the utilization of the enzymes in the production of bioethanol from lignocelluloses. Myceliophthora thermophila (synonym Sporotrichum thermophile) is a thermophilicfilamentous fungus, isolated from soil in eastern Russia, classified as an ascomycete, and constitutesan exceptionally powerful cellulolytic organism; it synthesizes a complete set of enzymes necessary forthe breakdown of cellulose. The genome of this fungus has been recently sequenced and annotated,allowing systematic examination and identification of enzymes required for the decomposition oflignocellulosic biomass. In this thesis, the genes encoding five cellulases, including twoendoglucanases belonging to glycoside hydrolase families GH5 and GH7, two cellobiohydrolasesbelonging to the families GH6 and GH7 and one β-glycosidase belonging to the family GH3, werecloned and expressed in methylotrophic yeast P. pastoris, and their properties were investigated. Inaddition, the enzymes were produced in high cell density cultures, in the controlled environment offermenters. The protein’s overexpression in a host suitable for industrial production is important inorder to achieve low-cost and highly efficient production. The enzymes were purified to theirhomogeneity and were used for the development of tailor-made enzyme mixtures targeted towardsparticular feedstocks, including agricultural and forest residues, where they were tested for their abilityto maximize hydrolysis yields.

Η κυτταρίνη αποτελεί το αφθονότερο οργανικό πολυμερές που συναντάται στη φύση, γεγονός που τηνκαθιστά κατάλληλη ως φτηνά αξιοποιήσιμη πηγή άνθρακα και πρώτη ύλη για ποικίλες βιοτεχνολογικέςεφαρμογές. Ως εκ τούτου, η απομόνωση νέων ενζύμων με δράση που στοχεύει στην αποικοδόμηση ήτην τροποποίηση των κυτταρινούχων υλικών κρίνεται απαραίτητη. Οι θερμόφιλοι οργανισμοίαποτελούν σημαντική πηγή κυτταρινολυτικών ενζύμων με πολλές βιοτεχνολογικές εφαρμογές, καθώςοι διεργασίες αυτές συνήθως απαιτούν συνθήκες υψηλής θερμοκρασίας. Ο Myceliophthora thermophilaείναι ένας θερμόφιλος αερόβιος μύκητας, ο οποίος αυξάνεται με μέγιστο ρυθμό σε θερμοκρασίες 45 –50 οC. Ο μύκητας παράγει πολλά θερμοσταθερά ένζυμα τα οποία έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστείκαι χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία σε βιοδιεργασίες που απαιτούν υψηλές θερμοκρασίες. Σκοπόςτης παρούσας εργασίας ήταν η απομόνωση και ετερόλογη έκφραση πέντε γονιδίων από το γονιδίωματου συγκεκριμένου μύκητα που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση τηςλιγνοκυτταρίνης, καθώς και η παραγωγή και ο καταλυτικός χαρακτηρισμός του ανασυνδυασμένωνενζύμων. Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες δύο ενδογλουκανασών των οικογενειών GH5 και GH7, δυοκελλοβιοϋδρολασών των οικογενειών GH6 και GH7 και μιας β-γλυκοσιδάσης της οικογένειας GH3ανασύρθηκαν από τη βάση δεδομένων Genome Portal, ενισχύθηκαν, κλωνοποιήθηκαν στονκατάλληλο φορέα και χρησιμοποιήθηκαν για το μετασχηματισμό και την ετερόλογη έκφραση στοζυμομύκητα P. pastoris. Ακολούθησε καθαρισμός των παραγόμενων πρωτεϊνών, τα οποία εν συνεχείαχρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία ενζυμικών μιγμάτων και δοκιμάστηκαν για την υδρολυτική τουςικανότητα έναντι φυσικών υποστρωμάτων αγροτικής και δασικής προέλευσης.