Παραγωγή οργανικών οξέων από λιγνοκυτταρινούχα συστατικά με τη χρήση γ-αλούμινας ως προωθητή

Abstract

Waste generation is an inevitable part of human activities. Wastes are producedfrom various sectors including forestry and agriculture residues, industrial wastesand by-products, and municipal wastes. Waste accumulation due to lack ofecological consciousness of the past decades, has created serious environmental,economic, and health problems, as well as obstacles towards sustainabledevelopment regarding the recycling and conservation of resources. The aboveissues combined with the increasing global energy demands, since fossil fuelreserves are becoming depleted and their prices increase (as well as the violentconflicts over their exploitation), have urged to find new perspectives to promotesustainable development in the frame of a circular economy. This necessity hasaffected the waste management practices and is being gradually fulfilled thoughnational and global guidelines. The scientific research and technologicaldevelopment could not be other than allies to such efforts.Lignocellulosic biomass constitutes the biggest part of wastes worldwide. Thiscarbon-rich material can be treated by various methods, of which anaerobicdigestion is a very promising approach. Anaerobic digestion includes a series ofmetabolic activities such as hydrolysis, acidogenesis, and methanogenesis. Undercontrolled conditions, the process can yield useful products such as biofuels andfertilizers, without any oxygen requirements.The AIM of the present thesis was to enhance the acidogenesis stage using γ-alumina as carrier of the mixed anaerobic culture and the production of organicacids by anaerobic treatment of lignocellulosic materials.In the FIRST PART, a literature review is provided with emphasis on anaerobicdigestion. The main biotechnological products as well as the technologies forexploitation of agroindustrial wastes, mainly of the food industries, are alsohighlighted and discussed. Moreover, the new trends on biofuels production areanalyzed, as well as the concerns regarding their production.The SECOND PART includes the experimental design of the thesis. The materials,instruments, lab equipment, microorganisms, experimental processes andanalytical techniques that were used in the thesis are listed and described.The experiments for the study of the acidogenesis of lignocellulosics were initiallycarried out using synthetic cellobiose media. This carbohydrate was chosen asmodel substrate since it is the basic repeated disaccharide, with β(1-4) glucosidicbond, that constitutes the cellulose polymer chain. The effect of three parameterson the acidogenic fermentation of synthetic cellobiose media, was studied on inorder to optimize the process conditions for maximum possible organic acidsproduction. The parameters were: initial pH of the fermentation substrate (3, 4.5,6, 7, 8 and 9), cellobiose concentration (20, 30, 50, and 70 g/L) and fermentationtemperature (27, 37 and 47oC). The experiments were carried out using free cellsof the mixed anaerobic culture in suspension as well as immobilized cells on γ-alumina pellets, in order to determine the promotional effect of the carrier and theimmobilization technique.Subsequently, development of a mathematical model was attempted for thefermentation of cellobiose in the presence of the promoter, in order to optimizethe conditions for application in the following lignocellulosic waste (straw)fermentations. The statistical analysis of the model indicated that the quadraticeffect of temperature was the most significant, followed by the quadratic effect ofinitial pH value, and the linear effect of cellobiose concentration. Among parametercombinations, the most preferable were fermentation temperature of 37oC, initialbroth pH 9.0, and low cellobiose concentration (30 g/L).Following, fermentation experiments were carried out using chemically delignifiedstraw as substrate. The straw replaced cellobiose and was used as the sole carbonsource. Fermentations were carried out in batch mode using free and immobilizedcells. The promotional effect of γ-alumina was again confirmed. The maximumorganic acids yield was 7 g/L, while the acids profile was similar to that obtained inthe case of cellobiose, with only exception the additional production of isobutyricacid during fermentations with immobilized cells.Lignocellulosic substrates, such as straw, require pretreatment in order to facilitatethe biochemical reactions of the acidogenesis step. Therefore, after the chemicaldelignification of straw using NaOH, the effect of biological cellulose hydrolysiswas studied, employing the fungus Trichoderma viride. After pretreatment withNaOH to remove lignin and cellulose swelling with T. viride, the pretreated strawwas used as fermentation substrate. The microbial hydrolysis led to slightlyimproved yields of organic acids, which were 10% and 5.5% for free cells andimmobilized cells, respectively.For the reduction of chemicals and costs required by thermical, chemicalpretreatment processes, microbial delignification of straw was subsequentlystudied using the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. The obtaineddelignified straw was compared with the chemically pretreated one, regardingmorphological and compositional differences, and the final organic acids yields inacidogenic fermentation experiments. The effect of moisture content was foundto affect the straw delignification level, which was 30.25% (at the highest moisturelevel; 85%), while chemical delignification leads to more than 60% lignin removal.However, the final outcome of the batch acidogenic fermentations was notsignificantly different, since the organic acids yields for chemically delignifiedstraw were up to 9.6 g/L for immobilized cells and 5.1 g/L for free cells, while theyields for biologically delignified straw (with 85% moisture) were 7.45 g/L and 3.96g/L, respectively.The effect of continuous operation on the outcome of the acidogenicfermentations was also evaluated. The continuous system was operated in thepresence of γ-alumina for 200 days at 37oC. Initially the system was fed withcellobiose substrate of 50 g/L, which was then reduced to 30 g/L concentration,followed by 30 g/L delignified straw suspension. The maximum percentage oforganic acids (50%) was observed during the 75th day of operation in cellobiosesubstrate. The organic acids profile was different between the two types ofsubstrates. Initially succinic and lactic acids prevailed, and subsequently butyric acidrose to about 83% of total acids.After the study of the various factors that affect the acidogenesis process,experiments for organic acids recovery were carried out using organic solvents,initially from standard aqueous solutions of the acids. The following solvents wereused: ethyl acetate, toluene, chloroform, diethyl ether, and 2-pentanol. Theextracted organic acids were succinic, lactic, propionic, butyric, and isobutyric acid.The effects of the different types of solvents and the ratios of organicsolution/solvent were studied. 2-Pentanol gave the best results, being able toextract all the different organic acids and at all the studied solution/solvent ratios,therefore, it was chosen for further studies in fermentation broths.Τhe delignified straw fermentation broth was extracted by 2-pentanol, based onthe above results, and the effects of filtration of the broth, pH, and the ratiobroth/solvent were evaluated. The ratio 1/1 seemed to yield the best results for allacids, since increase of the solvent in the mixture did not further improve theextraction yield. The yields were improved when filtration of the broth was applied.Finally, the reduction of the broth pH from 5.5 to 2.5 significantly increased theextraction yields. Further reduction of pH had no effect except in the case of lacticacid.Finally, the CONCLUSIONS of the thesis are provided in the last chapter. The use ofγ-alumina as promoter improved the organic acids production yields. The factorsthat were studied for optimization of the acidogenesis process (initial pH, sugarconcentration, temperature), gave satisfactory results in the attempt to develop amathematical model for the process. The biological delignification of the processwas successful, providing a promising alternative for the pretreatment of thesematerials and their subsequent acidogenic fermentation. The conventionalextraction of the produced acids with organic solvents gave very good results.Among solvents, 2-pentanol was proved the most efficient and is proposed since itcan be used simultaneously as suitable solvent for organic acids extraction and asreagent for the subsequent esterification reactions to produce ester-basedbiofuels similar to biodiesel, but without competing with food production as didthe first generation biodiesel

Η παραγωγή αποβλήτων είναι ένα αναπόσπαστο κομμάτι της ανθρώπινης δραστηριότητας. Τα απόβλητα παράγονται από διάφορους τομείς συμπεριλαμβανομένων των βιομηχανιών, της δασοκομίας, της γεωργίας και των πόλεων. Η συσσώρευση αποβλήτων λόγω της απουσίας οικολογικής συνείδησης των περασμένων δεκαετιών δημιούργησε σοβαρά περιβαλλοντικά, και οικονομικά προβλήματα, προβλήματα υγείας, και εμπόδια προς την κατεύθυνση της αειφόρου ανάπτυξης, όσον αφορά την ανακύκλωση και διατήρηση πόρων.Ο συνδυασμός των προαναφερθέντων με την ολοένα αυξανόμενη ζήτηση σε καύσιμα σε παγκόσμια κλίμακα, αφού τα αποθέματα ορυκτών καυσίμων μειώνονται, και οι τιμές τους αυξάνονται (όπως και οι βίαιες συγκρούσεις για την εκμετάλλευση τους), οδήγησε στην ανάγκη εύρεσης νέων προοπτικών για την προώθηση βιώσιμης ανάπτυξης σε ένα πλαίσιο κυκλικής οικονομίας. Η ανάγκη αυτή έχει επηρεάσει τις πρακτικές διαχείρισης αποβλήτων και σταδιακά ικανοποιείται μέσα από κατευθυντήριες γραμμές τόσο σε εθνικό όσο και διεθνές επίπεδο. Η επιστημονική έρευνα και η τεχνολογική ανάπτυξη δεν θα μπορούσαν παρά να είναι αρωγοί σε μια τέτοια προσπάθεια.Η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα αποτελεί το μεγαλύτερο μέρος των αποβλήτων σε παγκόσμιο επίπεδο. Η πλούσια αυτή πηγή άνθρακα μπορεί να επεξεργαστεί με διάφορες μεθόδους, και η αναερόβια χώνευση φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση. Η αναερόβια χώνευση περιλαμβάνει μια σειρά από μεταβολικές δραστηριότητες όπως η υδρόλυση, η οξεογένεση και η μεθανογένεση. Υπό ελεγχόμενες συνθήκες η διεργασία έχει τη δυνατότητα να παρέχει χρήσιμα προϊόντα, όπως βιοκαύσιμα και εδαφοβελτιωτικά, χωρίς την απαίτηση παροχής οξυγόνου στο σύστημα. ΣΤΟΧΟΣ της παρούσας διατριβής ήταν η ενίσχυση του σταδίου της οξεογένεσης με τη χρήση γ-αλούμινας ως φορέα ακινητοποίησης της μικτής αναερόβιας καλλιέργειας και η παραγωγή οργανικών οξέων κατά την αναερόβια επεξεργασία λιγνινοκυτταρινούχων υλικών. Στο ΠΡΩΤΟ ΜΕΡΟΣ της διατριβής γίνεται βιβλιογραφική ανασκόπηση με έμφαση στην αναερόβια χώνευση. Γίνεται αναφορά στα κύρια βιοτεχνολογικά προϊόντα καθώς και στις τεχνολογίες αξιοποίησης των αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων,κυρίως της βιομηχανίας τροφίμων. Επιπροσθέτως, αναλύονται τα κύρια βιοκαύσιμα, οι νέες τάσεις για την παραγωγή τους, καθώς και οι ανησυχίες που ανακύπτουν από την παραγωγή τους.Το ΔΕΥΤΕΡΟ ΜΕΡΟΣ περιλαμβάνει τον πειραματικό σχεδιασμό της διατριβής.Περιγράφονται οι πρώτες ύλες (λιγνινοκυτταρινούχο υλικό, άχυρο), τα όργανα και ο εργαστηριακός εξοπλισμός που χρησιμοποιήθηκε, οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιήθηκαν, και οι πειραματικές και αναλυτικές τεχνικές που υιοθετήθηκαν.Τα πειράματα για την μελέτη της οξεογένεσης λιγνινοκυταρινούχων υλικών έγιναν αρχικά σε συνθετικό μέσο κελλοβιόζης. Ο υδατάνθρακας αυτός επιλέχθηκε ως πηγή άνθρακα επειδή είναι ο βασικός δισακχαρίτης, με β(1-4) γλυκοζιτικό δεσμό, από τον οποίο αποτελείται το πολυμερές της κυτταρίνης.Στο συνθετικό μέσο κελλοβιόζης έγινε μελέτη της επίδρασης τριών παραμέτρων της ζύμωσης με σκοπό την βελτιστοποίηση των συνθηκών και τη μεγιστοποίηση των συγκεντρώσεων των οργανικών οξέων. Οι παράμετροι που μελετήθηκαν ήταν η αρχική τιμή pH του υποστρώματος ζύμωσης (3, 4,5, 6, 7, 8 και 9), η συγκέντρωση του σακχάρου (20, 30, 50, και 70 g/L) και η θερμοκρασία της ζύμωσης (27, 37 και 47 oC). Τα πειράματα έλαβαν χώρα τόσο με τη χρήση ελεύθερων κυττάρων της μικτής αναερόβιας καλλιέργειας όσο και με την χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων σε πελλέτες γ-αλούμινας για να διαπιστωθεί η προωθητική δράση του φορέα ακινητοποίησης.Στη συνέχεια έγινε προσπάθεια ανάπτυξης μαθηματικού μοντέλου για τιςζυμώσεις παρουσία του προωθητή, η οποία είχε ως στόχο τη βελτιστοποίηση των συνθηκών που θα χρησιμοποιούνταν στις ζυμώσεις του αποβλήτου (άχυρου). Η στατιστική ανάλυση του μοντέλου έδειξε ότι η τετραγωνική επίδραση της θερμοκρασίας ήταν ο σημαντικότερος παράγοντας και ακολουθούσε η τετραγωνική επίδραση της αρχικής τιμής pH και η γραμμική επίδραση της συγκέντρωσης της κελλοβιόζης. Μεταξύ των πιθανών συνδυασμών των τιμών των παραγόντων που μελετήθηκαν για τη μεγιστοποίηση της παραγωγής οργανικών οξέων, επιλέχθηκαν οι συνθήκες:37oC θερμοκρασία, pH 9,0 και 30 g/L συγκέντρωση σακχάρου.Οι ζυμώσεις στο επόμενο στάδιο έγιναν σε υπόστρωμα χημικώς απολιγνινοποιημένου άχυρου. Το άχυρο αντικατέστησε την κελλοβιόζη και χρησιμοποιήθηκε ως η μόνη πηγή άνθρακα. Οι ζυμώσεις έγιναν σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου με ελεύθερα και ακινητοποιημένα κύτταρα.Η προωθητική δράση της γ-αλουμίνας επιβεβαιώθηκε και σε αυτές τις ζυμώσεις.Η μέγιστη συγκέντρωση των οξέων για τα ακινητοποιημένα κύτταρα έφτασε τα 7 g/L ενώ το προφίλ των οξέων που παρήχθησαν ήταν παρόμοιο με εκείνο των ζυμώσεων κελλοβιόζης με εξαίρεση την εμφάνιση ισοβουτυρικού οξέος στις ζυμώσεις χημικώς απολιγνινοποιημένου άχυρου παρουσία γ-αλουμίνας. Τα λιγνοκυτταρινούχα υποστρώματα, όπως το άχυρο, χρειάζονται προεπεξεργασία πριν τη ζύμωση τους για να διευκολυνθούν οι βιοχημικές διεργασίες που συμβαίνουν κατά στο στάδιο της οξεογένεσης. Συνεπώς, μετά τη χημική απολιγνινοποίηση με διάλυμα NaOH, ακολούθησε η μελέτη της βιολογικής υδρόλυσης της κυτταρίνης με τη βοήθεια του μύκητα Trichodermaviride. Μετά την προεπεξεργασία του άχυρου με NaOH για την απομάκρυνση της λιγνίνης και την υδρόλυση από τον μύκητα, χρησιμοποιήθηκε το υδρόλυμα και το υπόλειμμα του απολιγνινοποιημένου υδρολυμένου άχυρου ως υπόστρωμα ζύμωσης. Η μικροβιακή υδρόλυση του άχυρου οδήγησε σε ελαφρώς αυξημένες αποδόσεις στην τελική συγκέντρωση των οξέων που ήταν 10% και 5,5% για τις ζυμώσεις των ελεύθερων κυττάρων και των ακινητοποιημένων σε γ-αλουμίνα,αντίστοιχα.Για την μείωση των χρησιμοποιούμενων χημικών και του κόστους που απαιτούνοι θερμικές διεργασίες, μελετήθηκε στη συνέχεια η μικροβιακή απολιγνινοποίηση του άχυρου με τη βοήθεια του μύκητα λευκής σήψηςPhanerochaete chrysosporium. Το απολιγνινοποιημένο άχυρο που προέκυψε,συγκρίθηκε με το χημικώς απολιγνινοποιημένο τόσο σε μορφολογικά χαρακτηριστικά, στη σύσταση του όσο και στην τελική απόδοση σε οργανικά οξέα μετά την οξεογένεση. Η επίδραση της υγρασίας του άχυρου φάνηκε να παίζει σημαντικό ρόλο ως προς το τελικό ποσοστό απολιγνινοποίησης. Τα επίπεδα απολιγνινοποίησης στο μέγιστο ποσοστό υγρασίας (85%) άχυρου κυμάνθηκαν στο 30,25% ενώ η χημική απολιγνινοποίηση δίνει ποσοστά που ξεπερνούν το 60%. Εντούτοις, το τελικό αποτέλεσμα της ζύμωσης δεν φαίνεται να διαφέρει σημαντικά καθώς τα ολικά οξέα σε ζυμώσεις διαλείποντος έργου για το χημικώς απολιγνινοποιημένο άχυρο φτάνουν τα 9,6 g/L για τα ακινητοποιημένα κύτταρα και τα 5,1 g/L για τα ελεύθερα κύτταρα, ενώ οι αντίστοιχες ποσότητες για τη ζύμωση του βιολογικώς απολιγνινοποιημένου άχυρου με ποσοστό υγρασίας 85% ήταν 7,45 g/L και 3,96 g/L.Εκτός από την επίδραση των παραπάνω παραγόντων σε ζυμώσεις διαλείποντος έργου, μελετήθηκε και η επίδραση της συνεχούς ζύμωσης στην τελική συγκέντρωση οργανικών οξέων. Το συνεχές σύστημα λειτούργησε παρουσία γ-αλουμίνας για 200 ημέρες στους 37oC. Αρχικά έγινε τροφοδοσία για την προσαρμογή του συστήματος με υπόστρωμα ζύμωσης κελλοβιόζης 50 g/L, στη συνέχεια η συγκέντρωση μειώθηκε στα 30 g/L και ακολούθησε η τροφοδοσία με εναιώρημα απολιγνινοποιημένου άχυρου (30 g/L). Το μέγιστο της παραγωγής οργανικών οξέων (50%) παρατηρήθηκε την 75η μέρα λειτουργίας σε υπόστρωμα κελλοβιόζης. Το προφίλ των παραγόμενων οργανικών οξέων ήταν διαφορετικό μεταξύ των δύο υποστρωμάτων ζύμωσης. Αρχικά επικράτησε το ηλεκτρικό και το γαλακτικό οξύ ενώ στη συνέχεια το βουτυρικό οξύ αποτέλεσε το 83% περίπου του συνόλου των οξέων.Μετά την μελέτη της επίδρασης όλων των παραγόντων που αφορούν την οξεογένεση, έγιναν πειράματα ανάκτησης των οργανικών οξέων με χρήση οργανικών διαλυτών. Αρχικά, τα πειράματα εκχύλισης έγιναν σε υδατικάδιαλύματα πρότυπων οργανικών οξέων με χρήση των διαλυτών: οξικός αιθυλεστέρας, τολουόλιο, χλωροφόρμιο, διαιθυλαιθέρας και 2-πεντανόλη. Τα οργανικά οξέα που εκχυλίστηκαν ήταν το οξικό, το ηλεκτρικό, το γαλακτικό, το προπιονικό, το βουτυρικό και το ισοβουτυρικό οξύ. Μελετήθηκε η επίδραση του διαλύτη και η επίδραση της αναλογίας υδατικού διαλύματος/διαλύτη. Η 2-πεντανόλη έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα από όλους τους διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν. Φαίνεται να εκχυλίζονται όλα τα οξέα σε όλες τις αναλογίες γι’ αυτό το λόγο επιλέχθηκε να μελετηθεί η εκχυλιστική της ικανότητα σε υγρό ζύμωσης.Το υγρό της ζύμωσης απολιγνινοποιημένου άχυρου εκχυλίστηκε με 2-πεντανόλη, με βάση τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τα πειράματα που προηγήθηκαν στα υδατικά διαλύματα και μελετήθηκε επίσης η επίδραση του φιλτραρίσματος του υγρού ζύμωσης, η μείωση του pH αλλά και η αναλογία υγρού ζύμωσης/2-πεντανόλης. Η αναλογία 1/1 φάνηκε να δίνει καλά αποτελέσματα για όλα τα οξέα, καθώς η περαιτέρω αύξηση της αναλογίας σε 2-πεντανόλη δεν έδειξε να βελτιώνει σημαντικά την εκχύλιση. Τα ποσοστά εκχύλισης αυξήθηκαν στο φιλτραρισμένο υγρό για όλα τα οξέα. Τέλος, η μείωση της τιμής του pH του υγρού ζύμωσης από 5,5 σε 2,5 αύξησε σημαντικά την εκχύλιση των οργανικών οξέων ενώ περαιτέρω μείωση του pH δεν φαίνεται να έχει θετική επίδραση στην εκχύλιση των οξέων με εξαίρεση το γαλακτικό οξύ. Τέλος, παρατίθενται τα ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ της διδακτορικής διατριβής. Η χρήσητης γ-αλουμίνας ως προωθητή, βελτίωσε σε όλες τις περιπτώσεις την απόδοση σε οργανικά οξέα. Οι παράγοντες που μελετήθηκαν όσον αφορά την μεγιστοποίηση του αποτελέσματος της οξεογένεσης (αρχική τιμή pH,συγκέντρωση σακχάρου, θερμοκρασία) έδωσαν ικανοποιητικά αποτελέσματα στην προσπάθεια μοντελοποίησης της διεργασίας. Η βιολογική απολιγνινοποίηση του λιγνινοκυτταρινούχου υλικού ήταν επιτυχής, δίνοντας μια εναλλακτική και πολλά υποσχόμενη διέξοδο στην προεπεξεργασία των υλικών αυτών για την μετέπειτα αξιοποίηση τους μέσω οξεογένεσης. Η συμβατική εκχύλιση των παραγόμενων οξέων με οργανικούς διαλύτες έδωσε πολύ καλά αποτελέσματα. Μεταξύ των διαλυτών επιλέχθηκε και ξεχώρισε η χρήση της 2-πεντανόλης, ως αλκοόλη που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί,εκτός από εκχυλιστικό μέσο, και ως αντιδρών στην μετέπειτα εστεροποίηση των οργανικών οξέων για την παραγωγή εστέρων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοκαύσιμα παρόμοια του βιοντίζελ, αλλά χωρίς ανταγωνισμό με την παραγωγή τροφίμων όπως το βιοντίζελ πρώτης γενιάς.