Λεπτομερής ενζυμικός χαρακτηρισμός μιας νέας ανθρώπινης ριβονουκλεάσης

Abstract

RNA metabolism is a constituent and fundamental part of the cellular function. Itis well known, that a wide range of cellular mechanisms and factors serve thesurveillance and immediate degradation of aberrant RNA molecules, while at thesame time control the degradation rates and stability of the transcripts, contributing tothe overall regulation of gene expression. Moreover, the maturation and processing ofthe RNA molecules, so that they gain their in vivo functionality, as well as thebiogenesis of all the classes of small RNAs, are of equal importance to RNAdegradation for the correct function of the cells. In order to understand this importantand particularly elaborate part of the cell metabolism, the thorough study of theenzymes that catalyze the hydrolysis of RNA, namely the ribonucleases, is consideredessential. Ribonucleases constitute one of the older and more heterogeneous enzymeclasses, which is represented in all kingdoms of life.The RNase κ family has been recently established and is being extensively studiedby our group. The RNase κ family is an orthologous protein family, that is representedin a wide range of metazoans expanding from the phylum of Cnidaria to the class of mammals. The protein representatives of this family are highly conserved andrelatively small, as they constitute of 95-105 amino acid residues. The studies of ourlaboratory are currently focused on the human representative of the RNase κ family.The human RNase κ gene is located on human chromosome 17 and retains theconserved organization pattern of the gene family, consisting of three exonsinterrupted by two introns. The encoded protein comprises of 98 amino acids andexhibits endoribonucleolytic activity.The further enzymatic study of human RNase κ constituted the first goal of thepresent thesis, while our second objective was the identification of functional aminoacids.Concerning our first goal, the modification of the protein production protocol viathe Pichia pastoris eukaryotic expression system, as well as the purification protocolresulted in the retrieval of larger amounts of homogeneous recombinant enzyme. Thepurified enzyme, retrieved from the new protocol, was used in order to study thesubstrate specificity of human RNase κ against a group of synthetic RNA and DNARNA substrates. The ribonucleolytic activity experiments against a 30-mer, 5΄-32PlabeledRNA revealed that human RNase κ preferentially hydrolyzes the ApG > ApU> UpA > UpU phosphodiester bonds. The above specificity pattern is in perfect agreement with previous results from our laboratory, occurring from the usage oflower purified enzyme, produced via different expression-purification protocols.The substrate specificity of the human enzyme was further tested against a groupof radiolabeled 5΄-dΝdΝdΝrAdNdNdNdN-3΄ octanucleotides, that contain only asingle ribonucleolytic cleavage site. As shown by the usage of 5΄-dΤdΤdΤrAdNdΤdΤdΤ-3΄ substrates, theribonucleolytic activity of human RNase κ is affected by the nucleotide thatfollows adenosine in the ΑpN phosphodiester bond, as the enzymepreferentially hydrolyzes the ApG> ApT> ApC-ApA bonds. Moreover, the human RNase κ ribonucleolytic activity is strongly affected bythe nucleotide sequence extending on both sides of the cleavage site, with thefollowing specificity: Τ>C-G>A, as shown by the use of 5΄-dNdNdNrAdGdNdNdN-3΄ substrates (where dN, is the samedeoxyribonucleotide in each substrate).In a next step, we investigated in detail the role of the five cysteine residues ofhuman RNase κ in its structure and function. The study of the effect of alkylating andreducing agents on the enzyme’s catalytic activity, in combination with theobservation of the electrophoretic mobility of the recombinant protein under reducingand non-reducing conditions revealed that: a) cysteine residues are not implicated inRNA catalysis and b) human RNase κ does not form homodimers through disulphidebridges, but contains one or more intramolecular disulfide bond(s) essential for itsribonucleolytic activity.The role of the cysteine residues was further investigated by expression and studyof Cys mutants. Ribonucleolytic activity experiments and SDS-PAGE analysis of thewild-type and mutant proteins under reducing and non reducing conditionsdemonstrated that Cys7, Cys14 and Cys85 are not essential for RNase activity. On theother hand, replacement of Cys6 or Cys69 with serine led to a complete loss ofcatalytic activity, indicating the necessity of these residues for maintaining an activeconformation of human RNase κ by forming a disulphide bond. Due to the absoluteconservation of these cysteine residues, the Cys6-Cys69 disulfide bond is likely to existin all RNase κ family members.In order to identify the amino acid residues of human RNase κ that participate inthe catalytic mechanism or in the binding and recognition of the RNA substrate, we initially proceeded with the construction of the mutant forms del10Lys, His36Ala andArg92Ala by site directed mutagenesis, aiming at the most conserved basic residuesof human RNase κ. The impact of the above mutations on the enzymatic properties ofhuman RNase κ was studied by: a) comparing the rate of hydrolysis of the substrate5΄-dTdTdTdTrAdGdTdTdTdT-3΄ by the wild-type and mutant enzymes, b)determining the Km value of the wild-type and mutant enzymes for the fluorigenicsubstrate 5΄-FAM-dTdTdTdTdTrAdGdTdTdTdTdT-BHQ1-3΄ (subΒ) and c)comparing the specificity pattern of the enzymes against a group of radiolabeled 5΄-dΤdΤdΤrAdNdΤdΤdΤ-3΄ octanucleotides. The above experiments revealed that: The deletion of Lys10 had no effect on either the ribonucleolytic activity orthe substrate specificity of the enzyme, which leads to the conclusion that thisresidue is not immediately involved in the catalytic mechanism or therecognition and binding of the RNA substrate, though its absoluteconservation. The mutant form His36Ala exhibits the same specificity pattern with the wildtypeenzyme but has a significantly reduced enzymatic activity, which is considered to be a consequence of its lower affinity for the substrate. The factthat the mutant form retains part of the activity of the wild-type enzyme,argues that His36 is unlikely to participate in an acid-base hydrolyticmechanism equivalent to those already described. Given that the histidineresidues have not yet been reported to take part in the binding of RNA, weconsider possible that the replacement of His36 with Ala influenced thestructural conformation of the enzyme, which in turn resulted in a loweraffinity for the substrate. Finally, the replacement of the residue Arg92 with Ala resulted in thereduction of the enzymatic activity with a parallel increase of the Km value forthe subB substrate, while it caused no modification of the enzyme’s specificitypattern. The above results imply that Arg92 may play a significant role in the«non-specific» binding of the RNA substrate, through its interaction with thenegatively charged phosphate backbone.Additional investigations of the enzyme protein structure by X-ray crystallography may further support the above findings and add insight on the catalytic mechanism of human RNase κ, which will in turn be an important tool for the investigation of theenzymes biological function.

Ο μεταβολισμός του RNA αποτελεί ένα θεμελιώδες και αναπόσπαστο κομμάτι τηςσωστής κυτταρικής λειτουργίας. Είναι γεγονός ότι μια πλειάδα μηχανισμών καικυτταρικών παραγόντων εξυπηρετούν την επιτήρηση και άμεση απομάκρυνση τωνελαττωματικών RNA μορίων, ενώ ταυτόχρονα ελέγχουν τον ρυθμό αποικοδόμησηςτων mRNAs συμβάλλοντας έτσι καθοριστικά στη συνολική ρύθμιση της γονιδιακήςέκφρασης. Πέρα όμως από την αποικοδόμηση, εξίσου σημαντικές είναι και οιαντιδράσεις ωρίμανσης-τροποποίησης που υφίστανται όλα ανεξαιρέτως τα RNAμόρια προκειμένου να αποκτήσουν την in vivo λειτουργικότητα τους, καθώς και οιμηχανισμοί βιογένεσης της πλειάδας των τάξεων μικρών RNAs. Για την κατανόησηαυτού του ιδιαίτερα σημαντικού αλλά και πολύπλοκου κομματιού του κυτταρικούμεταβολισμού καθίσταται απαραίτητη η ενδελεχής μελέτη των ενζύμων πουκαταλύουν τις αντιδράσεις διάσπασης του RNA, δηλαδή των ριβονουκλεασών. Οιριβονουκλεάσες αποτελούν μια από τις αρχαιότερες και πιο ετερογενείς ομάδεςενζύμων, που εξαπλώνεται σήμερα σε όλους ανεξαρτήτως τους οργανισμούς.Από το εργαστήριο μας έχει πρόσφατα εγκαθιδρυθεί και μελετάται συστηματικά η οικογένεια των ριβονουκλεασών κ. Πρόκειται για μια ορθόλογη οικογένειαπρωτεϊνών που αντιπροσωπεύεται σε ένα πολύ μεγάλο εύρος μεταζώων καιεξαπλώνεται από το φύλο των Κνιδοζώων έως την τάξη των θηλαστικών. Οιπρωτεϊνικοί αντιπρόσωποι της οικογένειας παρουσιάζουν ιδιαίτερα αυξημένησυντηρητικότητα, ενώ έχουν μικρό μέγεθος, της τάξης των 85-105 αμινοξικώνκαταλοίπων. Τα τελευταία χρόνια οι μελέτες του εργαστηρίου μας εστιάζονται στονανθρώπινο αντιπρόσωπο. Το γονίδιο της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ εντοπίζεταιστο χρωμόσωμα 17, διατηρεί το χαρακτηριστικό πρότυπο οργάνωσης των γονιδίωντης οικογένειας, αποτελούμενο από τρία εξώνια που διακόπτονται από δύο εσώνια,ενώ εκφράζεται σε όλους σχεδόν τους ιστούς και τα αναπτυξιακά στάδια. Η πρωτεΐνηπου κωδικοποιείται αποτελείται από 98 αμινοξέα και εμφανίζειενδοριβονουκλεολυτική ενεργότητα.Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει κινηθεί σε δύο κατευθύνσεις. Η πρώτηπεριλαμβάνει την πληρέστερη ενζυμική μελέτη της human RNase κ, ενώ η δεύτερητον προσδιορισμό αμινοξικών καταλοίπων που συμβάλλουν στη λειτουργικότητα του ενζύμου.Στα πλαίσια του πρώτου στόχου, η τροποποίηση του πρωτοκόλλου παραγωγής τηςRNase κ στο ευκαρυωτικό σύστημα του ζυμομύκητα Pichia pastoris αλλά και του χρωματογραφικού καθαρισμού της, οδήγησε στην ανάκτηση μεγαλύτερωνποσοτήτων ανασυνδυασμένου ενζύμου σε πλήρως ομογενή μορφή.Το ένζυμο που προέκυψε από το νέο πρωτόκολλο έκφρασης-καθαρισμούχρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση της υποστρωματικής εξειδίκευσης τηςανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ, έναντι μιας σειράς συνθετικών RNA και RNA-DNAυποστρωμάτων. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων προσδιορισμού της ενζυμικήςενεργότητας έναντι ενός μονόκλωνου 30μερούς RNA υποστρώματος, το οποίοπεριλαμβάνει όλους τους διαφορετικούς φωσφοδιεστερικούς δεσμούς, έδειξαν ότι ηhuman RNase κ υδρολύει επιλεκτικά και κατά σειρά προτίμησης τους ApG > ApU >UpA > UpU δεσμούς. Το παραπάνω πρότυπο υποστρωματικής εξειδίκευσηςσυμφωνεί με τα αποτελέσματα προηγούμενων πειραμάτων του εργαστηρίου μας, σταοποία χρησιμοποιήθηκε ανασυνδυασμένο ένζυμο μικρότερου βαθμού καθαρότητας,που παράγεται από την εφαρμογή διαφορετικού πρωτοκόλλου έκφρασης-καθαρισμού.Σε συνέχεια των πειραμάτων αυτών, ακολούθησε η χρήση μιας σειράςδιαφορετικών οκτανουκλεοτιδίων του τύπου 5΄-dΤdΤdΤrAdNdΤdΤdΤ-3΄ και 5΄-dΝdΝdΝrAdGdNdNdN-3΄, που περιέχουν μια μοναδική θέση υδρόλυσης από τηνανθρώπινη ριβονουκλεάση κ. Η σύγκριση της εξειδίκευσης του ανθρώπινου ενζύμουως προς τα διαφορετικά υποστρώματα αποκάλυψε ότι: Η ενεργότητα της RNase κ επηρεάζεται από το νουκλεοτίδιο που ακολουθείτην αδενίνη στον προς διάσπαση ApN δεσμό, αφού το ένζυμο διασπά κατάσειρά προτίμησης τους δεσμούς ApG> ApT> ApC-ApA. Επιπλέον, η ενεργότητα της RNase κ επηρεάζεται από την αλληλουχία τωνβάσεων εκατέρωθεν του δεσμού υδρόλυσης. Συγκεκριμένα, το ανθρώπινοένζυμο εμφανίζει μεγαλύτερη εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα που φέρεινουκλεοτίδια θυμίνης εκατέρωθεν του ApG δεσμού, υδρολύει σε αρκετάμικρότερο βαθμό τα υποστρώματα με νουκλεοτίδια γουανίνης και κυτοσίνηςστις αντίστοιχες θέσεις, ενώ δεν μπορεί να διασπάσει τον φωσφοδιεστερικόδεσμό όταν εκατέρωθεν αυτού υπάρχουν κατάλοιπα αδενίνης.Οι ριβονουκλεάσες της οικογένειας κ περιλαμβάνουν 3-5 κατάλουπα κυστεϊνών,εκ των οποίων οι κυστεΐνες 6, 14 και 69 (αρίθμηση με βάση τον ανθρώπινο αντιπρόσωπο) είναι απόλυτα συντηρημένες. Στα πλαίσια της προσπάθειαςεντοπισμού των αμινοξικών καταλοίπων που συμβάλλουν στη λειτουργικότητα του ενζύμου, αρχικά διερευνήθηκε λεπτομερώς ο ρόλος των 5 καταλοίπων κυστεΐνης τηςανθρώπινης RNase κ. Η μελέτη της επίδρασης αλκυλιωτικών και αναγωγικώνπαραγόντων στην ενεργότητα του ενζύμου, σε συνδυασμό με την μελέτη τηςηλεκτροφορητικής κινητικότητας της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης υπό αναγωγικέςκαι μη συνθήκες, αποκάλυψαν ότι η ανθρώπινη ριβονουκλεάση κ δεν σχηματίζειομοδιμερή μέσω δισουλφιδικών γεφυρών, ενώ τα κατάλοιπα κυστεΐνης δενεμπλέκονται στην καταλυτική της ενεργότητα, αλλά συμμετέχουν στον σχηματισμόενός τουλάχιστον ενδομοριακού δισουλφιδικού δεσμού.Ο ρόλος του κάθε καταλοίπου κυστεΐνης στη στερεοδιαμόρφωση-ενεργότητα τουενζύμου διερευνήθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένες μορφές τηςανθρώπινης RNάσης κ, που προέκυψαν από την αντικατάσταση του κάθε καταλοίπουκυστεΐνης με σερίνη. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που προέκυψαν μέσω τηςέκφρασης στο ευκαρυωτικό σύστημα του ζυμομύκητα Pichia pastoris, καθαρίστηκανσε ομογενή μορφή και χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα προσδιορισμού τηςριβονουκλεολυτικής ενεργότητας καθώς και σε πειράματα ανάλυσης σε πηκτώματαSDS-PAGE υπό αναγωγικές και μη αναγωγικές συνθήκες. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών αποκάλυψαν ότι τα κατάλοιπα Cys7, Cys14 και Cys85 δενσυμμετέχουν στο σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών και δεν επηρεάζουν τηνενζυμική ενεργότητα της ανθρώπινης RNάσης κ. Αντίθετα, η αντικατάσταση τωνκαταλοίπων Cys6 ή Cys69 με σερίνη επηρεάζει την ηλεκτροφορητική συμπεριφοράτης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης απουσία και παρουσία β-μερκαπτοαιθανόλης καιοδηγεί σε ολοκληρωτική απώλεια της ενζυμικής ενεργότητας, υποδεικνύοντας ότι τακατάλοιπα αυτά συμμετέχουν στο σχηματισμό ενός ενδομοριακού δισουλφιδικούδεσμού, απαραίτητου για την αναδίπλωση του μορίου στη λειτουργική του μορφή. Ηαπόλυτη συντηρητικότητα των καταλοίπων Cys6 και Cys69 υπαινίσσεται ότι ο δεσμόςαυτός είναι πιθανότατα συντηρημένος σε όλους τους αντιπροσώπους της οικογένειας.Με σκοπό τώρα τον εντοπισμό αμινοξέων της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ πουσυμμετέχουν στον καταλυτικό μηχανισμό ή στην αναγνώριση-δέσμευση του RNAυποστρώματος, προχωρήσαμε σε ένα πρώτο βήμα στη στόχευση των περισσότεροσυντηρημένων βασικών αμινοξικών καταλοίπων Lys10, His36 και Αrg92 μεκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση. Οι αντίστοιχες μεταλλαγμένες μορφές του ενζύμου del10Lys, His36Ala και Arg92Ala παρήχθησαν στο ευκαρυωτικό σύστημα του ζυμομύκητα Pichia pastoris και καθαρίστηκαν σε ομογενή μορφή, σύμφωνα με τοπρωτόκολλο που ακολουθήσαμε και για το φυσικού τύπου ένζυμο.Η μελέτη της επίδρασης των μεταλλαγών αυτών στη λειτουργικότητα της RNase κέγινε: α) με σύγκριση του ρυθμού υδρόλυσης του υποστρώματος 5΄-dTdTdTdTrAdGdTdTdTdT-3΄ από το φυσικού τύπου και τα μεταλλαγμένα ένζυμα,β) με προσδιορισμό του Κm των ενζύμων έναντι του υποστρώματος 5΄-FAMdTdTdTdTdTrAdGdTdTdTdTdT-BHQ1-3΄ (subΒ) και γ) με σύγκριση του προτύπουεξειδίκευσης που εμφανίζουν τα μεταλλαγμένα ένζυμα έναντι μιας σειράςσυνθετικών υποστρωμάτων του τύπου 5΄-dΝdΝdΝrAdΝdNdNdN-3΄σε σχέση με τηφυσικού τύπου RNase κ. Ο προσδιορισμός του Km της RNase κ και τωνμεταλλαγμένων μορφών της επετεύχθη βάσει ενός πρωτοκόλλου συνεχούς ενζυμικήςδοκιμασίας με χρήση φθορίζοντος υποστρώματος, το οποίο αναπτύχθηκε στα πλαίσιατης παρούσας διατριβής. Από τα πειράματα αυτά προέκυψε ότι: Η απαλοιφή της Lys στη θέση 10 δεν επηρέασε ούτε τη ριβονουκλεολυτικήενεργότητα αλλά ούτε και την υποστρωματική εξειδίκευση του ενζύμου, κάτι που υποδεικνύει ότι, παρά την απόλυτη συντηρητικότητα του, το εν λόγωαμινοξύ δε συμμετέχει άμεσα στον καταλυτικό μηχανισμό ή στη δέσμευσητου RNA υποστρώματος. Η μεταλλαγμένη μορφή His36Ala εμφανίζει το ίδιο πρότυπο εξειδίκευσης,αλλά μειωμένη ενεργότητα σε σύγκριση με το φυσικού τύπου ένζυμο, κάτιπου βρέθηκε ότι οφείλεται πιθανότατα στην ελαττωμένη συγγένεια του για τουπόστρωμα. Η διατήρηση ενός ποσοστού της ενζυμικής ενεργότητας από τομεταλλαγμένο ένζυμο αποκλείει τη συμμετοχή της His36 της RNase κ σεμηχανισμό όξινης-βασικής κατάλυσης, αντίστοιχο με αυτούς που έχουν ωςσήμερα περιγραφεί. Θεωρούμε πολύ πιθανόν ότι η μικρότερη συγγένεια πουεμφανίζει η μεταλλαγμένη μορφή έναντι του υποστρώματος subΒ, οφείλεταιστη διαταραχή της στερεοδιαμόρφωσης του ενζύμου εξαιτίας τηςαντικατάστασης του καταλοίπου ιστιδίνης με κατάλοιπο αλανίνης. Η αντικατάσταση του καταλοίπου Arg92 με Ala οδήγησε επίσης σεσημαντική μείωση της ενζυμικής ενεργότητας και αύξηση της τιμής Km έναντι του υποστρώματος subΒ, χωρίς παράλληλη τροποποίηση του προτύπουυποστρωματικής εξειδίκευσης. Το αποτέλεσμα αυτό αποτελεί ισχυρή ένδειξηότι το συγκεκριμένο αμινοξύ διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στη δέσμευση του RNA υποστρώματος, καθώς τα κατάλοιπα Arg συμμετέχουνσυχνά στη μη ειδική δέσμευση του RNA μέσω της αλληλεπίδρασης τους μετις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες των νουκλεοτιδίων.Ως μελλοντική προσέγγιση, καθοριστικής σημασίας κρίνεται η κρυσταλλογραφικήμελέτη της δομής της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ, η οποία αφενός θα υποστηρίξειπεραιτέρω τα παραπάνω ευρήματα και αφετέρου θα βοηθήσει στη διαλεύκανση τουκαταλυτικού μηχανισμού του συγκεκριμένου ενζύμου, ο οποίος με τη σειρά του θααποτελέσει πολύτιμο εργαλείο στην προσπάθεια προσδιορισμού του βιολογικούρόλου της πρωτεΐνης αυτής.