Αυτοφαγία στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα: ο ρόλος του HIF-1a/REDD1 μοριακού μονοπατιού

Abstract

Myelodysplastic syndromes (MDS) comprise a heterogeneous group of clonal hematopoietic stem (HSCs) and/or progenitor cells (HPCs) disorders. The established dependence of MDS progenitors on the hypoxic bone marrow (BM) microenvironment turned scientific interests to the transcription factor Hypoxia-Inducible factor 1 (HIF-1). HIF-1 facilitates quiescence maintenance and regulates differentiation by manipulating HSCs metabolism, being thus an appealing research target.In the first section of the study, we examine the aberrant HIF-1 stabilization in BMs from MDS patients.Methods: BΜ aspiration samples, as well as BM biopsies, were collected from 16 newly diagnosed previously untreated MDS patients and 7 controls with non-malignant hematologic disorder. qRT-PCR and flow cytometry analysis were respectively used for the assessment of mRNA and protein levels of HIF-1α and HIF-1 direct transcriptional target, regulated in development and DNA damage responses 1 (REDD1), in BM aspiration samples A nitroimidazole-indocyanine conjugate was used for the study of the hypoxic phenotype in BM biopsies, as well as in cultured CD34+ BM cells. Autophagy and mitophagy were examined by means of immunofluorescence and electron microscopy. We finally performed in vitro cultures of human BM derived CD34+ HSCs under myeloid priming using a functional HIF-1α inhibitor.Results: We show that HIF-1 aberrant expression and transcription activity is oxygen independent establishing the phenomenon of pseudohypoxia in MDS BM. Next, we examine mitochondrial quality and quantity along with levels of autophagy in the differentiating myeloid lineage isolated from fresh BM MDS and control aspirates given that both phenomena are HIF-1 dependent. We show that mitophagy of abnormal mitochondria and autophagic death are prominently featured in the MDS myeloid lineage, their severity increasing with intra-BM blast counts. Finally, we use in vitro cultured CD34+ HSCs isolated from fresh human BM aspirates to manipulate HIF-1 expression and examine its potential as a therapeutic target. We find that despite cultured under 21% O2, HIF-1 remained aberrantly stable in all MDS cultures. Inhibition of HIF-1α subunit had a variable beneficial effect in all <5%-intra-BM blasts-MDS, while it had no effect in controls or in >5%-intra-BM blasts-MDS that uniformly died within 3 days of culture.Conclusions: We conclude that HIF-1 and pseudohypoxia are prominently featured in MDS pathobiology and their manipulation has some potential in the therapeutics of benign MDS.In the second section of the study, we examine the different metabolic profile of MDS myeloid lineage with low and high BM blast percentage.Methods: We performed an untargeted metabolomic analysis of differentiating myeloid lineage cells from MDS BM aspirates that exhibited <5% (G1) or ≥5% (G2) blasts, in order to delineate its role in MDS severity and malignant potential. BM aspirates were collected from 14 previously untreated MDS patients (G1, n = 10 and G2, n = 4) and age matched controls (n = 5). Following myeloid lineage cell isolation, untargeted mass spectrometry-based metabolomics analysis was performed. Data were processed and analyzed using Metabokit. Enrichment analysis was performed using Metaboanalyst v4 employing pathway-associated metabolite sets.25Results: We established a bioenergetic profile coordinated by the Warburg phenomenon in both groups, but with a massively different outcome that mainly depended upon each group mitochondrial function and redox state. G1 cells are overwhelmed by glycolytic intermediate accumulation due to failing mitochondria, while the functional electron transport chain and improved redox in G2 compensate for Warburg disruption. Both metabolomes reveal the production and abundance of epigenetic modifiers. G1 and G2 metabolomes differ and eventually determine the MDS clinical phenotype, as well as the potential for malignant transformation.Conclusion: Our findings suggest that a perturbed metabolism underlies the syndrome’s pathogenesis and also determines the disease severity. We also propose that these bioenergetic alterations are essentially featured in and indeed drive the process of leukemic transformation. Our data not only offer novel insight into the elusive MDS pathophysiology, but also change our viewpoint on MDS-related acute myeloid leukemia biology.

Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) αποτελούν μια ετερογενή ομάδα κλωνικών διαταραχών των αιμοποιητικών αρχέγονων κυττάρων (Hematopoietic Stem Cells – HSCs) ή προγονικών κυττάρων (Hematopoietic Progenitor Cells – HPCs). Η τεκμηριωμένη εξάρτηση των προγονικών κυττάρων των ΜΔΣ από το υποξικό περιβάλλον του μυελού των οστών (ΜΟ) έχει στρέψει το ερευνητικό ενδιαφέρον στον επαγόμενο από την υποξία μεταγραφικό παράγοντα 1 (Hypoxia Inducible Factor 1 – HIF-1). Ο HIF-1 διαμεσολαβεί τη διατήρηση της ηρεμίας και ρυθμίζει τη διαφοροποίηση τροποποιώντας το μεταβολισμό των HSCs, αποτελώντας έτσι έναν ελκυστικό θεραπευτικό στόχο.Στο πρώτο τμήμα της παρούσας μελέτης, διερευνήθηκε η παθολογική σταθεροποίηση του HIF-1 στο ΜΟ ασθενών με ΜΔΣ.Μέθοδοι: Δείγματα αναρρόφησης ΜΟ και οστεομυελικές βιοψίες συλλέχθηκαν από 16 ασθενείς με πρωτοδιάγνωση ΜΔΣ και από 7 μάρτυρες χωρίς κακοήθη αιματολογική διαταραχή. Μελέτη με qRT-PCR και κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε αντίστοιχα για την εκτίμηση των επιπέδων του mRNA και της πρωτεΐνης του HIF-1α και του άμεσου μεταγραφικού στόχου του HIF-1, regulated in development and DNA damage responses 1 (REDD1) σε δείγματα αναρρόφησης ΜΟ. Η αυτοφαγία και η μιτοφαγία μελετήθηκαν με ανοσοφθορισμό και παρατήρηση σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν in vitro καλλιέργειες CD34+ HSCs ΜΟ με κατεύθυνση διαφοροποίησης προς μυελική σειρά με τη χρήση ενός λειτουργικού αναστολέα του HIF-1α.Αποτελέσματα: Δείξαμε ότι η παθολογική έκφραση και μεταγραφική δραστηριότητα του HIF-1α είναι ανεξάρτητη από το οξυγόνο τεκμηριώνοντας το φαινόμενο της ψευδοϋποξίας στο ΜΟ των ΜΔΣ. Ακολούθως, μελετήσαμε την ποιότητα και την ποσότητα των μιτοχονδρίων παράλληλα με τα επίπεδα αυτοφαγίας στα διαφοροποιούμενα κύτταρα της μυελικής σειράς μετά την απομόνωση από δείγματα αναρρόφησης ΜΟ, δεδομένου ότι και τα δύο φαινόμενα είναι εξαρτώμενα από τον HIF-1. Δείξαμε ότι η μιτοφαγία των παθολογικών μιτοχονδρίων και ο αυτοφαγικός θάνατος αποτελούν κυρίαρχο χαρακτηριστικό της μυελικής σειράς των ΜΔΣ, με τη βαρύτητά τους να αυξάνεται με το ποσοστό των βλαστών του ΜΟ. Τέλος, χρησιμοποιήσαμε in vitro καλλιέργειες CD34+ HSCs απομονωμένων από δείγματα αναρρόφησης ΜΟ προκειμένου να επηρεάσομε την έκφραση του HIF-1 και να μελετήσουμε το δυναμικό του ως θεραπευτικού στόχου. Διαπιστώσαμε ότι παρότι οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε παροχή οξυγόνου 21%, ο HIF-1 παρέμενε παθολογικά σταθερός σε όλες τις καλλιέργειες των ΜΔΣ. Η αναστολή του HIF-1α είχε διαφορετικού βαθμού θετική επίδραση σε όλες τις καλλιέργειες των ΜΔΣ με < 5% βλάστες, ενώ δεν είχε καμία επίδραση στις καλλιέργειες των ΜΔΣ με ≥5% βλάστες, οι οποίες δεν επιβίωναν μετά την τρίτη μέρα της καλλιέργειας.Συμπεράσματα: Συμπεραίνουμε ότι ο HIF-1 και η ψευδοϋποξία αποτελούν κυρίαρχο χαρακτηριστικό της παθοφυσιολογίας των ΜΔΣ και η επίδραση επί αυτών μπορεί να έχει κάποιο δυναμικό στη θεραπευτική των ήπιων ΜΔΣ.Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, διερευνήσαμε τα διαφορετικά μεταβολικά προφίλ της μυελικής σειράς ΜΔΣ με χαμηλά και υψηλά ποσοστά βλαστών.Μέθοδοι: Πραγματοποιήθηκε μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση των διαφοροποιούμενων κυττάρων της μυελικής σειράς από δείγματα αναρρόφησης ΜΟ23ασθενών με ΜΔΣ με <5% (G1) ή ≥5% (G2) βλάστες, με στόχο να διερευνήσουμε το ρόλο του μεταβολισμού στη βαρύτητα και το κακόηθες δυναμικό των ΜΔΣ. Δείγματα αναρρόφησης ΜΟ συλλέχθηκαν από 14 ασθενείς με ΜΔΣ, οι οποίοι δεν είχαν λάβει θεραπεία (G1, n=10 και G2, n=4) και από αντίστοιχης ηλικίας μάρτυρες (n=5). Μετά από απομόνωση των κυττάρων της μυελικής σειράς, πραγματοποιήθηκε μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση. Η επεξεργασία και η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το Metabokit. Η ανάλυση εμπλουτισμού πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Metaboanalyst v4 με εφαρμογή σχετιζόμενων με μονοπάτια ομάδων μεταβολιτών.Αποτελέσματα: Τεκμηριώσαμε ένα βιοενεργητικό προφίλ που συντονίζεται από το φαινόμενο Warburg και στις δύο ομάδες, με σημαντικά διαφορετικό αποτέλεσμα που εξαρτάται από τη λειτουργία των μιτοχονδρίων και την οξειδοαναγωγική κατάσταση κάθε ομάδας. Τα κύτταρα της ομάδας G1 παρουσιάζουν συσσώρευση ενδιάμεσων μεταβολιτών της γλυκόλυσης λόγω δυσλειτουργίας των μιτοχονδρίων, ενώ η λειτουργική αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων και η βελτιωμένη οξειδοαναγωγή της ομάδας G2 εξισορροπεί τη διαταραχή Warburg. Το μεταβόλομα και των δύο ομάδων παρουσιάζει αφθονία επιγενετικών τροποποιητών. Το μεταβόλομα της ομάδας G1 και G2 διαφέρει και τελικά καθορίζει τον κλινικό φαινότυπο του ΜΔΣ, καθώς και το δυναμικό για κακοήθη μετατροπή.Συμπέρασμα: Τα ευρήματά μας προτείνουν ότι ο διαταραγμένος μεταβολισμός συμμετέχει στην παθογένεση του συνδρόμου και καθορίζει επίσης τη βαρύτητα της νόσου. Προτείνουμε επίσης ότι αυτές οι βιοενεργητικές μεταβολές χαρακτηρίζουν και οδηγούν τη λευχαιμική μετατροπή. Τα δεδομένα μας δεν παρέχουν απλά μια νέα θεώρηση στην παθοφυσιολογία των ΜΔΣ, αλλά τροποποιούν και την επικρατούσα άποψη για τη βιολογία της σχετιζόμενης με ΜΔΣ ΟΜΛ.