Ρύθμιση του προγράμματος διαφοροποίησης και πολλαπλασιασμού των βλαστικών κυττάρων στα πλαίσια της Ras/Erk οδού μέσω του μεταγραφικού παράγοντα ERF

Abstract

The purpose of this thesis is to study the role of the erf gene in development, differentiation and carcinogenesis through transgenic animal stem cells.The Erf is an important regulator in the main mitotic RTK / Ras / Erk pathway and is involved in cell proliferation. It has also been shown that it can suppress ets-and ras-dependent carcinogenesis in fibroblasts. It is the target of Erks with which interacts and gets phosphorylated. This causes his export from the nucleus. The nuclear Erf stops the cell cycle at the phase G0/G1.In our laboratory we created transgenic mice with gene deletion of Erf (Erf knock-out) and we studied the development in all embryonic stages. These studies have shown that the knock-out strains have defects in development and there is no chorionic trophoblast differentiation, absence of chorioallantoic fusion, persisting chorionic layer, reduced spongiotrophoblast layer, disorganized layers of spongiotrophoblast and giant cells and finally embryonic death in the tenth (E10.5) day of pregnancy due to food deficiency.According to these observations and the study of the expression of Erf in the various stages of embryogenesis and placenta formation, it was important to investigate the role of Erf in the differentiation of trophoblast cells towards the spongiotrophoblast and syncytiotrophoblast. For this purpose, we examined differentiating trophoblast cells in in vitro assays. We used four (4) cell lines: wild type (WT) trophoblasts, trophoblast cells with deletion of Erf (Erf knock-out), trophoblast cells overexpressing the wild type protein Erf and trophoblast cells overexpressing the M1-7 Erf. In this mutant, Erf lacks the 7 phosphorylation sites by of the Erks, resulting in its nuclear detection and therefore in a continuously activated form. After analyzing the expression levels of different genes markers specific for each differentiation stage, we came up with the following conclusions:• The wild-type cells, follow a path of differentiation towards spongiotrophoblasts and giant cells.• The cells with the deletion of Erf, show a delayed differentiation program, giving populations of giant cells.• The cells overexpressing the wild type Erf, differentiate into spongiotrophoblast cells.• The cells overexpressing the nuclear form of Erf (M1-7), led to syncytiotrophoblasts and giant cells.From the above observations, we came up with a differentiation model that suggests the involvement of Erf with the specification of the spongiotrophoblasts and syncytiotrophoblasts, forcing the differentiation towards these lineages.ChIP-seq experiments indicated that Fgf2, a factor supporting TSC maintenance, may be regulated by Erf. Analysis of differentiating Erf-KO TSCs revealed high levels of Fgf2 compared to WT TSCs. Expression of an RTK/Ras/Erk insensitive ERF mutation in TSCs, totally suppressed Fgf2 expression. Promoter assays suggested a direct regulation of Fgf2 transcription by Erf. Collectively these data suggest that Erf contributes to TSC differentiation, silencing the inappropriate expression of Fgf2.Thus our data indicate that Erf may actively contribute to syncytiotrophoblast lineage development beyond its effect on chorionic trophoblast cells mediated by Fgf2 regulation.Apart from the abnormalities observed in the absence of Erf during the placenta formation there are also abnormalities observed during embryogenesis in the absence of Erf. Specifically, embryos exhibit defects in the head and neural structures, such as neural tube. DNA microarrays analysis in our laborator has demonstrated the transcriptional repression activity of Erf on olig1, which is a marker gene of oligodendrocytes in the process of myelination. Furthermore, ERF increased during in vivo remyelination (RTK-dependent process).We considered, therefore, important to study the possible role of Erf in neural differentiation. For this purpose we used wild type embryonic stem cells and cells with deletion of Erf. By examining the gene expression of Erf +/+ and Erf-/- stem cells in differentiating conditions, we found an increased potential for differentiating cells towards oligodendrocytes in the absence of Erf.For the differentiation of embryonic stem cells we used a special nutrient medium for directed neural differentiation in monolayer. Such protocol gave mainly populations of nerve cells and less glial cells. So, it was necessary to change the culture conditions. It was decided, therefore, to differentiate the cells through the creation of embryoid bodies, an experiment that is underway. With the observations so far, this procedure enriches the culture by glial cells, according to the morphology of differentiating cells.In parallel, we created transgenic animals with conditional gene deletion of Erf. Thus, we have in disposal Emx-1-cre and Meox2-cre mice, with the second ones showing embryonic lethality. Here, we show that reduced dosage of ERF causes complex craniosynostosis (premature fusion of the cranial sutures) in humans and mice. Features of this newly recognized clinical disorder include multiple-suture synostosis, craniofacial dysmorphism, Chiari malformation and language delay. Mice with functional Erf levels reduced to ~30% of normal exhibit postnatal multiple-suture synostosis; by contrast, embryonic calvarial development appears mildly delayed. Using chromatin immunoprecipitation in mouse embryonic fibroblasts and high-throughput sequencing, we find that ERF binds preferentially to elements away from promoters that contain RUNX or AP-1 motifs. This work identifies ERF as a novel regulator of osteogenic stimulation by RAS-ERK signaling, potentially by competing with activating ETS factors in multifactor transcriptional complexes.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη του ρόλου του γονιδίου erf στην ανάπτυξη, διαφοροποίηση και καρκινογένεση, μέσω διαγονιδιακών ζώων και βλαστικών κυττάρων.Ο Erf είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής στην κύρια μιτωτική RTK/Ras/Erk οδό και ενέχεται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Έχει δειχθεί επίσης ότι μπορεί να καταστείλει την ets- και ras- εξαρτώμενη καρκινογένεση σε ινοβλάστες. Αποτελεί στόχο των Erks με τις οποίες αλληλεπιδρά και φωσφορυλιώνεται. Αυτό έχει ως συνέπεια την έξοδό του από τον πυρήνα και την απενεργοποίηση του. Ο πυρηνικός Erf σταματά τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G0/G1.Έχουν δημιουργηθεί στο εργαστήριό μας ποντίκια με απαλοιφή του γονιδίου του Erf (Erf knock-out) και έχει μελετηθεί η πορεία ανάπτυξης σε όλα τα εμβρυικά στάδια. Οι μελέτες αυτές έχουν δείξει πως τα knock-out στελέχη παρουσιάζουν ανωμαλίες στην ανάπτυξη και συγκεκριμένα δεν παρατηρείται διαφοροποίηση στη χοριονική τροφοβλάστη, απουσία της χοριοαλλαντοϊκής σύντηξης, «έντονη» χοριονική στοιβάδα, ελάττωση της έκτασης της σπογγιοτροφοβλάστης, αποδιοργανωμένες στοιβάδες της σπογγιοτροφοβλάστης και των γιγαντιαίων κυττάρων και τέλος πρόκληση εμβρυικού θανάτου κατά τη δέκατη (Ε10.5) μέρα της κύησης λόγω τροφικής ανεπάρκειας.Σύμφωνα με τις παραπάνω παρατηρήσεις καθώς και τη μελέτη της έκφρασης του Erf στα διάφορα στάδια της εμβρυογένεσης και πλακουντογένεσης, κρίθηκε σημαντική η διερεύνηση του ρόλου του Erf κατά τη διαφοροποίηση των τροφοβλαστικών κυττάρων σε σπογγιοτροφοβλάστη και συγκυτιοτροφοβλάστη. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκαν πειράματα διαφοροποίησης τροφοβλαστικών κυττάρων in vitro. Έγινε χρήση τεσσάρων (4) κυτταρικών σειρών: τροφοβλαστικά κύτταρα αγρίου τύπου (WT), τροφοβλαστικά κύτταρα με απαλοιφή του Erf (Erf knock-out), τροφοβλαστικά κύτταρα που υπερεκφράζουν τον αγρίου τύπου Erf και τέλος τροφοβλαστικά κύτταρα που υπερεκφράζουν τον Μ1-7 Erf. Στο μετάλλαγμα αυτό, ο Erf, στερείται των 7 θέσεών του φωσφορυλίωσης από τις Erks, με αποτέλεσμα τον πυρηνικό του εντοπισμό και συνεπώς μια συνεχώς ενεργοποιημένη μορφή. Έπειτα από ανάλυση των επιπέδων έκφρασης διαφόρων γονιδίων-μαρτύρων για τα στάδια διαφοροποίησης, προέκυψαν τα εξής συμπεράσματα:•Τα αγρίου τύπου κύτταρα, ακολουθούν μια πορεία διαφοροποίησης προς σπογγιοτροφοβλαστικά κι γιγαντιαία κύτταρα.•Τα κύτταρα με την απαλοιφή του Erf, παρουσιάζουν καθυστέρηση στο πρόγραμμα διαφοροποίησης, δίνοντας πληθυσμούς γιγαντιαίων κυττάρων.•Τα κύτταρα που υπερεκφράζουν τον αγρίου τύπου Erf, διαφοροποιούνται προς σπογγιοτροφοβλαστικά κύτταρα.•Τα κύτταρα που υπερεκφράζουν τη συνεχώς πυρηνική μορφή του Erf (Μ1-7), οδηγούνται προς συγκυτιοτροφοβλάστες και γιγαντιαία κύτταρα.Από τα παραπάνω προκύπτει ένα μοντέλο διαφοροποίησης που προτείνει την εμπλοκή του Erf στον καθορισμό της σπογγιοτροφοβλαστικής και συγκυτιοτροφοβλαστικής γενεαλογίας, προάγοντας τη διαφοροποίηση προς αυτές τις κατευθύνσεις.Πειράματα ChIP-seq έδειξαν ότι ο FGF2, ένας παράγοντας που συμβάλλει στη διατήρηση των TSC, μπορεί να ρυθμίζεται από τον ERF. Ανάλυση της διαφοροποίησης Erf-KO TSCs αποκάλυψαν υψηλά επίπεδα FGF2 σε σύγκριση με τα WT TSCs. Έκφραση ενός μετάλλαγματος του ERF που δεν αποκρίνεται στη σηματοδότηση μέσω RTK / Ras / ERK σε TSCs, καταστέλλει εντελώς την έκφραση του FGF2. Αναλύσεις υποκινητή πρότειναν την άμεση μεταγραφική ρύθμιση του FGF2 από τον ERF. Συλλογικά αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι o ERF συμβάλλει στη διαφοροποίηση των TSC, πέρα από την επίδρασή του στα χοριακά τροφοβλαστικά κύτταρα μέσω της ρύθμισης του Fgf2.Εκτός από τις ανωμαλίες που παρατηρούνται κατά την πλακουντογένεση απουσία του Erf, έχουν επίσης παρατηρηθεί και ανωμαλίες κατά την εμβρυική ανάπτυξη απουσία του Erf. Συγκεκριμένα, τα έμβρυα παρουσιάζουν ανωμαλίες στην περιοχή του κεφαλιού και σε νευρικές δομές, όπως ο νευρικός σωλήνας. Με πειράματα ανάλυσης DNA με microarrays στο εργαστήριό μας, έχει δειχθεί η μεταγραφική κατασταλτική δράση του Erf στο γονίδιο olig1 , που αποτελεί μάρτυρα των ολιγοδενδροκυττάρων που συμμετέχουν στη διαδικασία της μυελινοποίησης. Τέλος, έχει παρατηρηθεί αύξηση των επιπέδων του Erf κατά τη διάρκεια της in vivo μυελινοποίησης, διαδιακασία που είναι RTK-εξαρτώμενη. Κρίθηκε, λοιπόν, σημαντική η μελέτη του πιθανού ρόλου του Erf στη νευρική διαφοροποίηση. Για το σκοπό αυτό έγινε χρήση εμβρυικών βλαστικών κυττάρων αγρίου τύπου και κυττάρων με απαλοιφή του Erf. Με εξέταση της γονιδιακής έκφρασης των Erf+/+ και Erf-/- βλαστικών κυττάρων υπό συνθήκες διαφοροποίησης, αποκαλύφθηκε ένα αυξημένο δυναμικό διαφοροποίησης προς ολιγοδενδροκύτταρα απουσία του Erf.Για τη διαφοροποίηση των εμβρυικών βλαστικών κυττάρων έγινε χρήση ειδικού θρεπτικού μέσου για κατευθυνόμενη νευρική διαφοροποίηση σε μονοστοιβάδα. Τέτοιου είδους πρωτόκολλο έδινε κυρίως πληθυσμούς νευρικών κυττάρων και λιγότερο γλοιακών κυττάρων. Οπότε, κρίθηκε απαραίτητη η αλλαγή στον τρόπο καλλιέργειας. Αποφασίστηκε, λοιπόν, διαφοροποίηση μέσω δημιουργίας εμβρυικών σωματιδίων, πείραμα το οποίο είναι σε εξέλιξη. Με τις μέχρι τώρα παρατηρήσεις, η διαδικασία αυτή εμπλουτίζει την καλλιέργεια με γλοιακά κύτταρα, σύμφωνα με τη μορφολογία των υπό διαφοροποίηση κυττάρων.Παράλληλα, έγινε δημιουργία διαγονιδιακών ζώων στα οποία πραγματοποιείται conditional απαλοιφή του γονιδίου του Erf. Έτσι έχουν προκύψει τα Emx-1-cre και Meox2-cre ποντίκια, με τα δεύτερα να εμφανίζουν εμβρυική θνησιμότητα. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε πως μειωμένα επίπεδα του μεταγραφικού καταστολέα Erf προκαλεί σύνθετη κρανιοσυνόστωση στους ανθρώπους και τα ποντίκια.Χαρακτηριστικά γνωρίσματα της πρόσφατα αναγνωρισμένης αυτής κλινικής διαταραχής αποτελούν η πολλαπλή συνοστέωση, η κρανιοπροσωπική δυσμορφία, η δυσπλασία Chiari και η γλωσσική καθυστέρηση. Ποντίκια με μειωμένα επίπεδα λειτουργικού Erf στο ~30% των φυσιολογικών επιπέδων εμφανίζουν μεταγεννητική πολλαπλή συνοστέωση. Αντίθετα, η ανάπτυξη των εμβρυικών κρανίων εμφανίζει ήπια καθυστέρηση. Χρησιμοποιώντας ανοσοκατακρήμνιση της χρωματίνης σε εμβρυικούς ινοβλάστες ποντικού καθώς και high-throughput αλληλούχιση, βρήκαμε ότι ο Erf προσδένεται με μεγάλη συνάφεια σε στοιχεία απομακρυσμένα από τους υποκινητές που περιέχουν τα RUNX και AP-1 μοτίβα. Η εργασία αυτή αναγνωρίζει τον Erf ως νέο ρυθμιστή της οστεογόνου διέγερσης μέσω RAS-ERK σηματοδότησης, πιθανώς ανταγωνιζόμενος με ETS ενεργοποιητές σε πολυπαραγοντικά μεταγραφικά σύμπλοκα.