Ο ρόλος του νευρογενετικού μορίου ΒΜ88/Cend 1 στον καθορισμό της μοίρας των Νευρικών Βλαστικών Κυττάρων σε φυσιολογικές συνθήκες και έπειτα από τραυματισμό του ΚΝΣ

Abstract

The brain damage is an extremely important problem of public health, while in most cases of brain injury, recovery is not feasible. In all cases of brain injury astroglia, a cell population of the CNS is being activated and plays an important role in the immune response in the brain. After brain injury, astrocytes react through multiple and complex changes in their morphology, in gene expression and activation of signaling pathways, eventually leading to the creation of the astroglia scar. Latest research studies indicate that alongside the trigger for the creation of the astroglia scar, astrocytes can be reprogrammed to different cellular types of CNS after brain injury. To this end, newer experimental data of astrocytic in vitro reprogramming towards neuronal cells and mature neurons capable of establishing active synapsis, has opened a new way of research in the field of regenerative medicine. These studies suggest that activated astroglia cells isolated even from non-neurogenic regions of the adult brain after local injury have the potential to be reprogrammed in vitro giving neurons capable of generating synapses after overexpression of specific transfer factors known to promote neurogenesis during embryonic development.A well studied transcription factor that induces the neurogenesis in expression studies on activated astrocytes is the bHLH pre-neural protein Neurogenin2, which induces the formation of gloutamatergic and dopaminergic neurons in vitro. Previous studies in our laboratory have shown that the neurogenic protein Cend1 participates in the path of neuronal differentiation, through the activation of the bHLH pre-neural genes Neurogenin 1 and 2. Furthermore, overexpression of Cend1 into neural stem cells leads to exit from the cell cycle and differentiation especially towards the neural phenotype. Finally, in vivo experiments of transplantation of neural stem cells overexpressing the protein Cend1 in the injured brain of mice, have shown that high expression of Cend1 in the transplanted cells leads to the induction of neuronal differentiation and in reduction of astrogliosis. Taking into account all the above data, the main objective of the present research work was to investigate the reprogramming potential of Cend1 combined with 2 Neurogenin (Neurog2) and the evaluation of their synergistic action on astrocytes, but also on MEFs, towards subtypes of neurons that are present in the cortex. In this respect, the study of potential re-programming of two molecules in vitro held in two cellular systems: a) in clean cultures of astrocytes isolated from cerebral cortex of mice aged 5 days old and b) in mouse embryonic fibroblast cultures. Our results indicate that over-expression of Cend1, Neurog2 or both in primary astrocytes leads to the creation of differentiated Gaba-ergic neurons after over-expression of Cend1 and dopaminergic or glutamatergic neurons after over-expression of Neurog2. Moreover, live cell imaging experiments, for a period of 1 week, showed that after the Cend1 overespression, astrocytes undergo 2-3 divisions before the trans-differentiate to neurons, unlike those overexpressing the Neurog2 protein that differentiated directly into neurons, without passing through division. To our surprise, on double transformed cultures with Cend1 and Neurog2, three-dimensional spheres appeared in culture with high reproductive potential. These cells, when cultured in the presence of neural stem cell media, developed as floating neurospheres, while in the absence of growth factors, they differentiated into neurons, astrocytes and oligodendrocytes, suggesting that they have dynamic neural stem cells.In meantime, we wanted to explore if the reprogramming potential of Cend1 and Neurog2 can lead to trans-differentiation of cells outside the nervous system and especially to the reprogramming of mouse embryonic fibroblasts towards neurons. So, we conducted reprogramming experiments using the viral vectors overexpressing the proteins Cend1 and Neurog2. Finally we observed the presence of differentiated electrophysiologically active neurons, which expressed subtype specific molecular markers (GABA, TH), at a rate close to 60% of the total number of cells in double transduced cultures. To investigate the molecular mechanism of action of the two molecules, Cend1 and Neurog2, in the reprogramming of astrocytes, we initially determined the expression levels of Cend1 and Neurog2 protein by immunostaining or the level of their mRNA by RT-PCR. The ensuing analysis revealed a positive feadback loop between those two molecules, while the endogenous suppression of Cend1 revealed that Cend1 is required for the completion of the neurogenic action Neurog2. The analysis of the results obtained from the PCR-arrays indicated the activation of the Wnt-β-catenin pathway especially on double transduced cultures, which pathway explains the appearance of the floating neurospheres, indicating that the simultaneous overexpression of the two molecules marks the induction of their neural stem cell character and their proliferative capacity. In conclusion our data suggest the existence of common reprogramming neurogenic mechanisms between CEND1 and NEUROG2 highlighting the important role of CEND1 in the path of NEUROG2 on the reprogramming of somatic cells to neurons.

Η εγκεφαλική βλάβη αποτελεί ένα εξαιρετικά σημαντικό πρόβλημα της δημόσιας υγείας, ενώ στις περισσότερες περιπτώσεις εγκεφαλικού τραυματισμού, η αποκατάσταση δεν είναι εφικτή. Σε όλες τις περιπτώσεις εγκεφαλικής βλάβης πραγματοποιείται ενεργοποίηση του κυτταρικού πληθυσμού των αστρογλοιακών κυττάρων του ΚΝΣ, τα οποία, μεταξύ άλλων, παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοσολογική απάντηση του εγκεφάλου. Μετά από τραυματισμό του εγκεφάλου τα αστροκύτταρα αντιδρούν μέσω πολλαπλών και πολύπλοκων αλλαγών στην μορφολογία τους, στη έκφραση γονιδίων και στην ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών, που τελικά καταλήγουν στην δημιουργία του αστρογλοιακού φραγμού. Τελευταίες ερευνητικές μελέτες υποδεικνύουν ότι παράλληλα με την ενεργοποίηση για τη δημιουργία του αστρογλοιακού φραγμού, τα αστροκύτταρα διαθέτουν δυναμικό επαναπρογραμματισμού τους προς διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους του ΚΝΣ έπειτα από εγκεφαλική βλάβη. Προς αυτή την κατεύθυνση, νεώτερα πειραματικά δεδομένα in vitro επαναπρογραμματισμού αστρογλοιακών κυττάρων του εγκεφαλικού φλοιού προς νευρογένεση και σχηματισμό λειτουργικών νευρώνων ικανών να δημιουργούν συνάψεις, έχει ανοίξει ένα νέο πεδίο έρευνας στο χώρο της αναγεννητικής ιατρικής. Οι μελέτες αυτές υποδηλώνουν ότι ενεργοποιημένα αστρογλοιακά κύτταρα απομονωμένα ακόμη και από μη-νευρογενετικές περιοχές του ενήλικου εγκεφάλου μετά από τοπικό τραυματισμό έχουν το δυναμικό να επανα-προγραμματιστούν in vitro δίνοντας νευρώνες ικανούς να δημιουργούν συνάψεις μετά από υπερέκφραση συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων γνωστών στην προώθηση της νευρογένεσης κατά την εμβρυική ανάπτυξη.Ένας καλά μελετημένος μεταγραφικός παράγοντας που επάγει τη νευρογένεση σε μελέτες υπερέκφρασης του σε ενεργοποιημένα αστροκύτταρα είναι η bHLH προ-νευρική πρωτεΐνη Neurogenin2, η οποία επάγει τον σχηματισμό γλουταματεργικών και ντοπαμινεργικών νευρώνων in vitro. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηριού μας έχουν δείξει ότι η νευρογενετική πρωτεΐνη Cend1 συμμετέχει στο μονοπάτι της νευρωνικής διαφοροποίησης, μέσω ενεργοποίησής της από τα bHLH προ-νευρικά γονίδια Neurogenin 1 και 2. Επιπλέον, υπερέκφραση του Cend1 σε νευρικά βλαστικά/προγονικά κύτταρα οδηγεί σε έξοδό τους από τον κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίησή τους ειδικά προς το νευρωνικό φαινότυπο. Τέλος, πειράματα μεταμόσχευσης νευρικών βλαστικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη Cend1 σε ένα ζωικό μοντέλο τραυματισμού του εγκεφαλικού φλοιού ποντικού, έχουν δείξει ότι υψηλή έκφραση της Cend1 στα μεταμοσχευμένα κύτταρα οδηγεί παράλληλα με την επαγωγή της νευρωνικής διαφοροποίησης τους σε μείωση της αστρογλοίωσης του γειτονικού νευροεκφυλισμένου εγκεφαλικού ιστού. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν τα παραπάνω δεδομένα, βασικός στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση του δυναμικού νευρωνικού επαναπρογραμματισμού του μορίου Cend1 σε συνδυασμό με την Neurogenin 2 (Neurog2) και η αξιολόγηση της συνεργιστικής δράσης των δυο μορίων στον κατευθείαν επανα-προγραμματισμό των αστροκυττάρων, αλλά και γενεαλογικά πιο απομακρυσμένων από το νευρικό σύστημα κυτταρικών τύπων, προς τους βασικούς υπότυπους νευρώνων που είναι παρόντες στο φλοιό. Προς αυτή την κατεύθυνση η μελέτη του δυναμικού επανα-προγραμματισμού των δύο νευρογενετικών μορίων πραγματοποιήθηκε in vitro σε δύο κυτταρικά συστήματα: α) σε καθαρές καλλιέργειες αστροκυττάρων προερχόμενων από εγκεφαλικό φλοιό ποντικών ηλικίας 5 ημερών και β) σε καλλιέργειες εμβρυικών ινοβλαστών ποντικού, που αποτελούν ένα κυτταρικό τύπο γενεαλογικά απομακρυσμένο από το νευρικό σύστημα.Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι υπερέκφραση του Cend1, της Neurog2 ή ταυτόχρονα και των δύο μαζί σε πρωτογενείς καλλιέργειες αστροκυττάρων οδηγεί στη δημιουργία διαφοροποιημένων Gaba-εργικών νευρώνων μετά από υπερέκφραση της Cend1 και ντοπαμινεργικών ή γλουταματεργικών νευρώνων έπειτα από υπερέκφραση της Neurog2. Επίσης πειράματα μικροσκοπίας ζωντανών κυττάρων για διάστημα 1 βδομάδας έδειξαν ότι μετά από υπερέκταση της Cend1, τα αστροκύτταρα υφίστανται 2-3 διαιρέσεις πριν δια-διαφοροποιηθούν προς νευρώνες, σε αντίθεση με αυτά που υπερεκφράζουν την Neurog2, τα οποία διαφοροποιούνται κατευθείαν προς νευρώνες, χωρίς να παρεμβληθεί πολλαπλασιασμός. Προς έκπληξή μας, στις διπλά μετασχηματισμένες καλλιέργειες με Cend1 και Neurog2 εμφανίζονται τρισδιάστατες σφαίρες με υψηλό πολλαπλασιαστικό δυναμικό. Τα κύτταρα αυτά, όταν καλλιεργούνται παρουσία υλικού νευρικών βλαστικών κυττάρων (ΝΒΚ), αναπτύσσονται ως αιρούμενες νευρόσφαιρες, ενώ απουσία των αυξητικών παραγόντων, διαφοροποιούνται προς τους τρεις κύριους τύπους της νευρωνικής γενεαλογίας, δηλαδή νευρώνες, αστροκύτταρα και ολιγοδενδροκύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι διαθέτουν δυναμικό νευρικών βλαστικών κυττάρων. Θέλοντας να διερευνήσουμε εάν το δυναμικό επαναπρογραμματισμού των Cend1 και Neurog2 νευρογενετικών πρωτεϊνών είναι ικανό να οδηγήσει σε ευρύτερη δια-διαφοροποίηση και συγκεκριμένα δια-διαφοροποίηση εμβρυικών ινοβλαστών προς νευρώνες, προχωρήσαμε σε πειράματα επαναπρογραμματισμού τους με τους ιικούς φορείς που υπερεκφράζουν τις Cend1 και Neurog2 πρωτεΐνες. Στις μετασχηματισμένες καλλιέργειες διαπιστώσαμε την παρουσία διαφοροποιημένων ηλεκτροφυσιολογικά ενεργών νευρώνων, οι οποίοι εκφράζουν και μάρτυρες υποτύπων νευρώνων (GABA, TH), σε ποσοστό που προσεγγίζει το 60% του συνολικού αριθμού των κυττάρων στις διπλά επιμολυσμένες καλλιέργειες.Για τη διερεύνηση του μοριακού μηχανισμού δράσης των δύο μορίων στον επαναπρογραμματισμό των αστροκυττάρων αρχικά προσδιορίσαμε τα επίπεδα έκφρασης των μορίων Cend1 και Neurog2 είτε σε επίπεδο πρωτεΐνης ανοσοϊστοχημικά είτε σε επίπεδο mRNA με RT-PCR. Η ανάλυση που ακολούθησε αποκάλυψε μία θετικά ανατροφοδοτούμενη λούπα μεταξύ των δύο αυτών μορίων, ενώ η ενδογενής αποσιώπηση του Cend1 αποκάλυψε ότι η Cend1 είναι απαραίτητη για την ολοκλήρωση της νευρογενετικής δράσης της Neurog2. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων από τα PCR-arrays υποδηλώνει την ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt-β-catenin ειδικά στις διπλά επιμολυσμένες καλλιέργειες, γεγονός το οποίο εξηγεί την εμφάνιση του φαινοτύπου των αιωρούμενων νευροσφαιρών, καθώς υποδηλώνει ότι η ταυτόχρονη υπερέκφραση των 2 μορίων σηματοδοτεί την επαγωγή του νευρικού βλαστικού χαρακτήρα τους και της πολλαπλασιαστικής τους ικανότητας. Εν κατακλείδι τα δεδομένα μας προτείνουν την ύπαρξη κοινών μηχανισμών νευρογενετικού επαναπρογραμματισμού μεταξύ των μορίων CEND1 και NEUROG2 αναδεικνύοντας τον σημαντικό ρόλο του CEND1 στο μονοπάτι της NEUROG2 κατά τον επαναπρογραμματισμό σωματικών κυττάρων προς νευρώνες.