Ex vivo visualization of megakaryocytic endomitosis and the role of cyclin E in process

Abstract

The endomitotic cell cycle in Megakaryocytes, which is comprised by repeated cycles of abrogated mitosis is an integral part of Megakaryocytic development . By utilizing a unique transgenic mouse model where GFP-histone expression is limited to megakaryocytic lineage we demonstrated that endomitosis is different between Megakaryocytes of high and low ploidy. In the low ploidy Megakaryocytes the DNA is clearly segregated into two distinct regions before it rejoins into a single nucleus. In High ploidy Megakaryocytes distinct segregation of DNA is not observed prior to DNA content rejoining into a single nucleus. Our study was the first one to describe the chromosomal dynamics of endomitosis Ex vivo using live imaging.In order to further characterize the endomitotic process efforts to generate transgenic mice that their microtubule network could be visualized were pursued. Several transgenic lines were generated without success and a novel approach is also outlined that may overcome the problems of previous transgenic mice attempts.In addition, based on transgenic mouse model where human Cyclin E1 overexpression is restricted in the megakaryocytic lineage we demonstrate that a higher fraction of bone marrow transgenic Megakaryocytes are in the S phase compared to wild type Megakaryocytes indicating that Cyclin E overexpression is sufficient to drive Megakaryocytes to S phase. Furthermore, a method to rapidly identify homozygotes from heterozygotes in the founder lines of transgenic mice is also described.Polo Like Kinase 3 is a protein that is implicated in the modulation of cell cycle and we detected its expression in Megakaryocytes but experiments using Knock out mice did not reveal an impact in polyploidization.Lysyl Oxidase propeptide (LOX-PP) is a moiety that is is part of the Pre Lysyl oxidase protein and is liberated when mature Lysyl oxidase is produced. It has been shown in multiple studies to exert a powerful anti- proliferation effect in cell lines and here we describe its effect in Megakaryocytic physiology and ploidy. Namely the Lysyl Oxidase Propeptide was able to inhibit Megakaryocytic polyploidization in bone marrow cultures without affecting viability. Importantly, Megakaryocytes expressing human Cyclin E1 were not able the inhibitory effect of LOX-PP.

ΠερίληψηΟ ενδομιτωτικος κύκλος των μεγακαρυοκύτταρων, ο οποίος αποτελείται από επαναλαμβανόμενους μη ολοκληρωμενους κύκλους μίτωσης αποτελεί αναπόσπαστο μέρος της μεγακαρυοκυτταρικης ανάπτυξης. Με την χρησιμοποίηση ενός μοναδικου διαγονιδιακόυ μοντέλου ποντικού, οπού η έκφραση της GFP-ιστόνης περιορίζεται στην μεγακαρυοκυτταρική κυταρρικη σειρα αποδείξαμε ότι ενδομίτωση είναι διαφορετική μεταξύ μεγακαρυοκύτταρων υψηλής και χαμηλής πλοειδίας. Στα χαμηλής πλοειδίας μεγακαρυοκύτταρα το DNA είναι σαφώς διαχωριζομενο σε δύο διακριτές περιοχές πριν επανασυσταθει σε ένα ενιαίο πυρήνα. Σε υψηλής πλοειδίας μεγακαρυοκύτταρα διαχωρισμός του DNA σε διακριτές περιοχές δεν παρατηρείται πριν από την επανασύνδεση του περιεχομένου του DNA σε ένα ενιαίο πυρήνα. Η μελέτη μας ήταν ο πρώτη που περιέγραψε την δυναμική των χρωμωσωματτων κατα την διάρκεια της ενδομίτωσης Ex-vivo χρησιμοποιώντας μικροσκοπία ζώντων κυττάρων.Προκειμένου να χαρακτηριστούν περαιτέρω οι διαδικασίες σχετιζόμενες με ενδομιτωση, έγιναν προσπάθειες για δημιουργία διαγονιδιακών ποντικών των οποίων το δίκτυο των μικροσωληνίσκων τους θα μπορούσε να παρατηρηθεί. Αρκετές διαγονιδιακές σειρές παρήχθησαν χωρίς επιτυχία και μια νέα προσέγγιση περιγράφεται που θα μπορούσε να ξεπεράσει τα προβλήματα των προηγούμενων διαγονιδιακων μοντέλων.Επιπλέον, με βάση ενα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού όπου η υπερέκφραση ανθρώπινης κυκλίνης Ε1 περιορίζεται στην μεγακαρυοκυτταρική κυτταρική σειρά έχουμε αποδείξει ότι ένας υψηλότερο κλάσμα των διαγονιδιακων μεγακαρυοκυτταρων του μυελού των οστών στην S φάση σε σύγκριση με το αγρίου τύπου μεγακαρυοκύτταρα υποδεικνύοντας ότι η υπερέκφραση της κυκλίνης Ε είναι επαρκής για να οδηγήσει μεγακαρυοκύτταρα στην S φάση. Περαιτέρω, μια μέθοδος για τον γηγορο εντοπισμό ομοζυγώτων από τους ετεροζυγώτες στις ιδρυτικές γραμμές (founder lines) διαγονιδιακών ποντικών περιγράφεται επίσης.Polo Like Kinase 3 είναι μια πρωτεΐνη που εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και ανιχνεύσαμε την έκφραση της σε μεγακαρυοκύτταρα, όμως πειράματα χρησιμοποιώντας Knock out ποντικια δεν αποκαλύπτουν μια επίδραση στη πολυπλοειδια.Το προπεπτιδιο της λυσυλ οξειδάσης (LOX-ΡΡ) είναι ενα πρωτεινικο θραύσμα μέρος της πρωτεΐνης Προ- λυσυλ οξειδάσης και απελευθερώνεται όταν η ωριμη λυσυλ οξειδάση παράγεται. Έχει αποδειχθεί σε πολλές μελέτες οτι ασκει μια ισχυρή αντι-αυξητική δραση σε κυτταρικές σειρές και εδώ περιγράφουμε την επίδρασή του στην φυσιολογία και στην πολυπλοειδια των μεγακαρυοκυτταρων. Δηλαδή το προπεπτιδιο της λυσυλ οξειδάσης ηταν ικανο να αναστείλει μεγακαρυοκυτταρική πολυπλοειδια σε καλλιέργειες μυελού των οστών χωρίς να επηρεάζει τη βιωσιμότητα. Ενα σημαντικο εύρημα ηταν οτι μεγακαρυοκύτταρα που εκφράζουν ανθρώπινη κυκλίνη Ε1 δεν ήταν σε θέση το αναστείλουν το αποτέλεσμα του LOX-ΡΡ.