Αντι-DNA μονοκλωνικά αυτoαντισώματα: επίδραση στην αγγειογένεση και στο δίκτυο των κυτταροκινών

Abstract

Antibodies with penetrating capacity into living cells (Cell-Penetrating Antibodies, CPAbs) were found in the serum of patients with Systemic Lupus Erythematosus (SLE) and in mouse models of the disease. For this purpose, a series of monoclonal antibodies (mAbs) was produced at the Laboratory of Immunology of the Hellenic Pasteur Institute, after fusion of non-secreting NSO myeloma cell line with splenocytes from non-immunized nine-month old male (NZBxNZW) F1 mice, which are spontaneously characterized by a lupus-like syndrome. Anti-DNA mAbs with penetrating ability into living cells were isolated from hybridomas and characterized in terms of their immunological properties, cell-penetrating capacity and subsequent biological activity. Specifically, we investigated the effect of their physical binding to DNA or other nuclear components on cell-penetration and their subsequent biological activity, as well as their potential effect on the angiogenic phenotype of endothelial cells. We thus selected five mAbs, among which three CPAbs (2 IgG2a: 10D2, 2C6 and an IgG2b: 5D3A8) and two non-penetrating mAbs (an IgG2a: H9.3 and one IgG2b: 1C5) to be used as negative controls. The 10D2, 5D3A8, 2C6 and H9.3 recognized nDNA as well as histones with different avidity, while the 1C5 recognized mainly actin. All three CPAbs also recognized other antigens, such as actin and carbonic anhydrase, thus expressing a distinct polyreactivity pattern. Antibodies isolated from hybridoma culture supernatants were found to penetrate in all cell lines (cancerous or not), mainly in the nucleus and/or cytoplasm, following a different pattern of penetration. The study of specific parameters of cell-penetration, demonstrated that the latter occurs rapidly at all concentrations tested, through a specific mechanism that does not require energy. In order to isolate CPAbs at large scale, we observed significant differences in the penetrating capacity between hybridoma culture supernatants and isolated CPAbs. It appeared that the penetration of three polyreactive CPAbs, was significantly enhanced in the presence of histones, DNA and particularly DNA-histones complex (DHC) favoring their accumulation in the nucleus. Regarding their biological activity it was found that CPAbs hydrolyze both plasmid and genomic DNA, in different degree (DNAse I activity). Furthermore, the three CPAbs did not affect cell proliferation but induced apoptosis in a significant percent of HeLa cells. On the other hand, CPAbs not only inhibited the proliferation of endothelial cells, but also reduced significantly their migration, while increased their survival co-operating with VEGF. To conclude, three monoclonal CPAbs from lupus prone mice, each of them exhibiting a distinct polyreactivity, cell-penetration and biological activity profile. The above distinct properties of the three CPAbs add new knowledge regarding i) the understanding of the pathogenesis of autoimmune diseases, such as SLE, and ii) their exploitation per se for therapeutic purposes.

Αντισώματα με ικανότητα διείσδυσης σε ζώντα κύτταρα (CPAbs) ανευρίσκονται στον ορό ασθενών με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ) και σε ποντικούς με πειραματική νόσο. Στο Eργαστήριο Ανοσολογίας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ παράχθηκε μια σειρά από μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) έπειτα από σύντηξη μη εκκριτικών μυελωματικών κυττάρων NSO με σπληνοκύτταρα από μη ανοσοποιημένα αρσενικά ποντίκια (NZBxNZW) F1, τα οποία εμφανίζουν αυθόρμητο σύνδρομο λύκου σε ηλικία εννέα μηνών. Αφού προσδιορίστηκαν τα υβριδώματα που εκκρίνουν αντι-DNA mAbs με ικανότητα διείσδυσης σε ζώντα κύτταρα (CPAbs), αυτά απομονώθηκαν και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ενδελεχής έλεγχος ως προς τα ανοσολογικά χαρακτηριστικά τους, τα χαρακτηριστικά διείσδυσης και την επακόλουθη βιολογική δράση τους. Ειδικότερα, διερευνήθηκε ο ρόλος της φυσικής σύνδεσης των CPAbs με το DNA και άλλα συστατικά του πυρήνα στη διεισδυτικότητα και τη βιολογική δραστικότητά τους, ενώ μελετήθηκε και η πιθανή επίδρασή τους στον αγγειογενετικό φαινότυπο των ενδοθηλιακών κυττάρων. Συνολικά επιλέχθηκαν πέντε mAbs, εκ των οποίων τρία CPAbs (2 IgG2a: 10D2, 2C6 και ένα IgG2b: 5D3Α8) και δύο μη διεισδυτικά mAbs (ένα IgG2a: Η9.3 και ένα IgG2b: 1C5) ως αρνητικοί μάρτυρες. Τα 10D2, 5D3A8, 2C6 και H9.3 αναγνώριζαν κυρίως το nDNA και τις ιστόνες, σε διαφορετικό βαθμό, ενώ το 1C5 αναγνωρίζει κυρίως την ακτίνη. Τα τρία CPAbs αναγνώριζαν ωστόσο και διάφορα άλλα αντιγόνα όπως ακτίνη και καρβονική ανυδράση, εκφράζοντας ένα διακριτό πρότυπο πολυδραστικότητας. Τα αντισώματα που απομονώθηκαν από τα υπερκείμενα καλλιέργειας των υβριδωμάτων βρέθηκαν να διεισδύουν σε όλες τις κυτταρικές σειρές (καρκινικές και μη), κυρίως στον πυρήνα (10D2, 5D3, 2C6) ή/και στο κυτταρόπλασμα, εμφανίζοντας όμως διαφορετικό πρότυπο διείσδυσης. Από τη μελέτη των παραμέτρων διείσδυσης, δείχθηκε πως εκείνη συντελείται τάχιστα, σε όλες τις υπό εξέταση συγκεντρώσεις των αντισωμάτων, μέσω ενός ειδικού μηχανισμού που δεν απαιτεί ενέργεια. Σημαντικές διαφορές στα χαρακτηριστικά διείσδυσης των υπερκειμένων κυτταροκαλλιέργειας συγκριτικά με τα απομονωμένα CPAbs διαπιστώθηκαν στην προσπάθεια απομόνωσης των τελευταίων σε μεγάλη ποσότητα. Φάνηκε ότι η διείσδυση των τριών πολυδραστικών CPAbs, ενισχύθηκε σημαντικά από την παρουσία των πυρηνικών μορίων DNA και ιστονών και ιδιαίτερα των νουκλεοϊστονών, ευνοώντας τον πυρηνικό εντοπισμό τους. Ως προς τη βιολογική τους δράση, δείχθηκε πως τα CPAbs υδρολύουν τόσο το πλασμιδιακό όσο και το γενωμικό DNA σε διαφορετικό βαθμό το καθένα (δράση DΝΑse Ι) και παρόλο που προκαλούν απόπτωση σε σημαντικό ποσοστό κυττάρων HeLa, δεν φαίνεται να επηρεάζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Αντίθετα, σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC, τα CPAbs ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό τους και μείωσαν σημαντικά τη μετανάστευσή τους. Παράλληλα, αύξησαν την επιβίωση των κυττάρων, δρώντας συνεργιστικά με τον VEGF. Συμπερασματικά, τρία μονοκλωνικά CPAbs προερχόμενα από ποντικούς με αυθόρμητη νόσο που προσομοιάζει τον ΣΕΛ, διαθέτουν ένα διαφορετικό προφίλ πολυδραστικότητας, διείσδυσης και βιολογικής δράσης. Οι παραπάνω διακριτές ιδιότητες των τριών CPAbs προσθέτουν νέα γνώση ως προς i) την κατανόηση της παθογένεσης αυτοάνοσων νοσήμάτων, όπως ο ΣΕΛ, και ii) την αξιοποίησή τους per se για θεραπευτικούς σκοπούς.