Χαρακτηρισμός και μελέτη της βιολογικής δράσης φυσικών αυτοαντισωμάτων με ικανότητα διείσδυσης σε ζώντα κύτταρα

Abstract

Antibodies with penetrating capacity into living cells (Cell-Penetrating Antibodies, CPAbs) have been studied in the serum of patients with Systemic Lupus Erythematosus (polyclonal antibodies) and in mouse models of the disease (monoclonal antibodies, mAbs), but never in physiological conditions. CPAbs are known to locate in the nucleus, recognize primarily DNA and interfere in various cellular functions. These disease-occurring CPAbs belong to IgG class and they share common features (e.g. polyreactivity recognizing many different antigens and germ-line gene encoding) with natural antibodies (NAbs). NAbs are found in healthy organisms, without exogenous stimulation and belong mainly to classes IgM, IgG, and IgA. The present study aims to investigate the existence and the properties of CPAbs in healthy organisms, man and mouse, at polyclonal and monoclonal level, respectively.We focus on studying: 1) sera from healthy individuals and more specifically therapeutic intravenous immunoglobulin (IVIg) preparations, which are known to be rich sources of NAbs, and 2) mAbs produced by hybridization of non-secretory myeloma cells with spleen cells from healthy BALB/c mice, that had been immunized with thyroglobulin in the presence of adjuvant, in order to enhance the production of IgG-NAbs. Antibodies were tested for their: a) cell-penetrating capacity by confocal microscopy, ELISA and FACs, b) antibody reactivity with ELISA against different antigens, and c) subsequent biological activityThe main findings are summarized below:1. Polyclonal antibodies (IgG) from healthy human sera (IVIg) were identified and isolated, and they were found to: a) penetrate into the cytoplasm, in vitro and in vivo, in different cell lines and cells from different organs of mice receiving intravenous IVIg, b) target histones, heparin and DNA; these isolated antibodies were polyreactive and all three represent the main cell-penetrating fraction of IVIg and, c) present a biological activity, in vitro, since they inhibit the expression of lymphocyte activation marker CD25 in splenocytes.2. Monoclonal antibodies (IgG) isolated from healthy mice were produced and found to: a) penetrate, in vitro, in different cell lines, located mainly in the cytoplasm and less frequently in the nucleolus, b) be polyreactive and belong to IgG1 and IgG2b subclasses, and c) have a biological activity, in vitro, as some of them hydrolyzed plasmid DNA (pBluescript), cause fragmentations in genomic DNA and induce morphological changes in the nucleus of HeLa cells.Overall, it is the first time that natural CPAbs are documented to be present in healthy organisms and differ from pathological CPAbs, in terms of their intracellular localization. Natural CPAbs were detected mainly in the cytoplasm of the cells, in contrast to the nuclear localization of pathological CPAbs. It remains to be investigated whether this difference is related to their role. In the long term, natural CPAbs can be exploited as therapeutic agents per se, as well as conjugated with bioactive agents, as intracellular transporters. Finally, a new field in the basic research is opened to further investigate the presence and the role of natural CPAbs in comparison to the pathological CPAbs.

Αυτοαντισώματα με ικανότητα διείσδυσης σε ζώντα κύτταρα (cell penetrating antibodies, CPAbs) έχουν μελετηθεί στον ορό ασθενών με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (πολυκλωνικά αντισώματα) και σε ποντικούς που εμφανίζουν αυθόρμητα σύνδρομο Λύκου (μονοκλωνικά αντισώματα, mAbs), αλλά ποτέ στη φυσιολογική κατάσταση. Τα CPAbs εντοπίζονται στον πυρήνα, αναγνωρίζουν κατά κύριο λόγο το DNA και επεμβαίνουν σε ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες. Είναι τάξης IgG και διαθέτουν χαρακτηριστικά φυσικών αντισωμάτων (πολυδραστικότητα, δηλαδή αναγνωρίζουν πολλά και διαφορετικά αντιγόνα, και κωδικοποίησή από γονίδια της βλαστικής σειράς). Τα φυσικά αυτοαντισώματα (natural autoantibodies, NAbs) ανευρίσκονται σε υγιείς οργανισμούς, χωρίς προηγούμενη εξωγενή διέγερση και ανήκουν κυρίως στις τάξεις IgM, IgG,και IgA. Η παρούσα εργασία έχει στόχο τη διερεύνηση καταρχήν της ύπαρξης, και στη συνέχεια των ιδιοτήτων των CPAbs σε υγιείς οργανισμούς, στον άνθρωπο και στον ποντικό, σε πολυκλωνικό και μονοκλωνικό επίπεδο, αντίστοιχα.Ειδικότερα μελετήθηκαν: 1) οροί υγιών ατόμων και συγκεκριμένα θεραπευτικά σκευάσματα ενδοφλέβιας ανοσοσφαιρίνης (intravenous immunoglobulin, IVIg), που αποτελούν πλούσια πηγή NAbs, και 2) mAbs που παρήχθησαν με τη διαδικασία της υβριδοποίησης μη εκκριτικών μυελωματικών κυττάρων με σπληνοκύτταρα από υγιείς ποντικούς BALB/c, που είχαν ανοσοποιηθεί με θυρεοσφαιρίνη παρουσία ανοσοενισχυτικού για να ευνοηθεί η παραγωγή IgG-NAbs. Τα αντισώματα ελεγχθήκαν ως προς: α) τη διεισδυτική ικανότητα με συνεστιακή μικροσκοπία, ELISA και FACs, β) την αντισωματική δράση τους με ELISA έναντι διαφόρων αντιγόνων και γ) την επακόλουθη βιολογική τους δράση Τα κύρια ευρήματα συνοψίζονται ως εξής:1. Προσδιορίστηκαν και απομονώθηκαν πολυκλωνικά αντισώματα (IgG) από τον ορό υγιών ανθρώπων (IVIg) με: α) ικανότητα να διεισδύουν στο κυτταρόπλασμα, in vitro και in vivo, σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές και σε κύτταρα από διάφορα όργανα ποντικών που έλαβαν ενδοφλέβια IVIg, β) αντιγόνο στόχο τις ιστόνες, την ηπαρίνη και το DNA απομονώθηκαν οι κύριοι διεισδυτικοί υποπληθυσμοί και βρέθηκαν να είναι πολυδραστικοί, και γ) βιολογική δράση, in vitro, αφού αναστέλλουν την έκφραση του λεμφοκυτταρικού δείκτη ενεργοποίησης CD25 στα σπληνοκύτταρα. 2. Παρασκευάστηκαν και απομονώθηκαν μονοκλωνικά αντισώματα (τάξης IgG) από υγιείς ποντικούς με: α) ικανότητα να διεισδύουν, in vitro, σε διαφορετικές σειρές και να εντοπίζονται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και λιγότερο συχνά στον πυρηνίσκο, β) πολυδραστικότητα και τα οποία ανήκαν στις υποτάξεις IgG1 και IgG2b, και γ) βιολογική δράση, in vitro, αφού ορισμένα από αυτά υδρολύουν το πλασμιδιακό DNA (pBluescript), κατακερματίζουν το γενωμικό DNA και επάγουν μορφολογικές αλλαγές στον πυρήνα των κυττάρων HeLa.Τεκμηριώνεται για πρώτη φορά η παρουσία φυσικών CPΑbs σε υγιείς οργανισμούς και αποδεικνύεται μια βασική διαφορά συγκριτικά με τα παθολογικά CPAbs, αυτή του ενδοκυτταρικού εντοπισμού τους, αφού τα πρώτα εντοπίζονται κυρίως στο κυτταρόπλασμα, σε αντίθεση με τον πυρηνικό εντοπισμό των παθολογικών CPAbs. Μένει να διερευνηθεί αν αυτή η διαφορά σχετίζεται με το ρόλο τους. Μακροπρόθεσμα, τα φυσικά CPAbs μπορούν να αξιοποιηθούν ως θεραπευτικοί παράγοντες τόσο per se, όσο και σαν ενδοκυττάριοι μεταφορείς δραστικών ουσιών, ενώ ένα νέο πεδίο βασικής έρευνας ανοίγεται για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου των φυσικών CPAbs σε σχέση με τα παθολογικά CPAbs.