Το μεταθετό στοιχείο Minos ως εργαλείο λειτουργικής γονιδιωματικής ανάλυσης στη δροσόφιλα

Abstract

At the present thesis the features of the mobile element Minos as a tool for genomic analysis in Drosophila have been examined. We have developed systems for the in vivo mobilisation of Minos – based transposons through the inducible expression of the transposase protein, which are characterised by high levels of transposition. The analysis of approximately 100 insertions of Minos in Drosophila revealed the ability of the element to insert in genes that have not been targeted by other mobile elements so far. Furthermore, Minos has been found to preferentially target the introns in comparison to the exons of the genes. The computational analysis of the primary structure and some physical properties of the DNA at the insertion sites showed that the primary structure of the DNA that surrounds the dinucleotides - target ΤΑ affects the target choice of the Minos transposase less, compared to other mobile elements that belong to the superfamily Tc1/mariner. The physical properties of the DNA at the insertion sites have an important impact on the target choice of the Minos transposase. Despite the fact that the Minοs insertions in introns have not been found to be mutagenic, we showed that the deletion of adjacent exonic sequences and, as a consequence, the mutation of the relative gene, can be generated through the mobilization of the transposon from the initial insertion site. We developed an enhancer trapping system with the use of the gene Gal4 as a first reporter gene. The genes expression patterns that have been observed with the certain technique and the expression patterns of the endogenous genes, as they were detected with the use of the RNA in situ hybridization technique, were similar. The analysis of approximately 1000 insertions of Minos that have been characterized by the Drosophila Genes Disruption Project group proved the ability of the element to insert with a higher frequency in new genes, than the P element. The use of Minos as the basic tool for the disruption of the Drosophila genes by the Drosophila Genes Disruption Project will greatly advance the completion of the relative project.

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν οι ιδιότητες του μεταθετού στοιχείου Minos ως εργαλείου γονιδιωματικής ανάλυσης στη Δροσόφιλα. Αναπτύχθηκαν συστήματα in vivo κινητοποίησης τρανσποζονίων του στοιχείου μέσω επαγόμενης έκφρασης τρανσποζάσης, που χαρακτηρίζονται από υψηλά ποσοστά κινητοποίησης των τρανσποζονίων. H ανάλυση 100 περίπου ενθέσεων του Minos στη Δροσόφιλα έδειξε τη δυνατότητα του στοιχείου να εντίθεται σε γονίδια στα οποία δεν έχουν επιλεχθεί ενθέσεις άλλων μεταθετών στοιχείων μέχρι τώρα. Επίσης, βρέθηκε ότι τα εσώνια των γονιδίων αποτελούν προτιμούμενους στόχους σε σχέση με τα εξώνια. Η ανάλυση της πρωτοταγούς δομής και των φυσικών ιδιοτήτων τoυ DNA στα σημεία ένθεσης του στοιχείου έδειξε ότι η πρωτοταγής ακολουθία του DNA που περιβάλλει τα δινουκλεοτίδια ΤΑ στα σημεία ένθεσης του στοιχείου επηρεάζει σε μικρότερο βαθμό την επιλογή της θέσης ένθεσης του Minos, σε σχέση με άλλα μεταθετά στοιχεία της υπεροικογένειας Tc1/mariner. Oι φυσικές ιδιότητες του DNA στις θέσεις ένθεσης του στοιχείου φαίνεται ότι επηρεάζουν σε σημαντικό βαθμό την επιλογή της θέσης ένθεσης. Αν και οι ενθέσεις του Minοs σε εσώνια γονιδίων δεν προκαλούν γονιδιακές μεταλλαγές, δείξαμε ότι η απαλειφή γειτονικών περιοχών εσωνίων και επομένως η μεταλλαγή του σχετικού γονιδίου μπορεί να γίνει μετά από την κινητοποποίηση του στοιχείου από την αρχική θέση ένθεσης. Αναπτύχθηκε ένα σύστημα παγίδευσης ενισχυτών με χρήση του γονιδίου Gal4 ως πρώτου γονιδίου αναφοράς. Τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης που ανιχνεύτηκαν με την τεχνική παγίδευσης ενισχυτών και τα πρότυπα έκφρασης των ενδογενών γονιδίων, όπως προέκυψαν μετά από την τεχνική του υβριδισμού με RNA, ήταν παρόμοια. Η ανάλυση 1000 ενθέσεων που χαρακτηρίστηκαν από την ομάδα του Προγράμματος μεταλλαγής των γονιδίων της Δροσόφιλας κατέδειξε το γεγονός ότι το στοιχείο Minοs εντίθεται με μεγαλύτερη συχνότητα σε νέα γονίδια σε σχέση με το στοιχείο Ρ. Η χρησιμοποίηση του Minοs ως βασικού εργαλείου μεταλλαγής των γονιδίων της Δροσόφιλας από το Πρόγραμμα μεταλλαγής των γονιδίων της Δροσόφιλας θα επισπεύσει την ολοκλήρωση του σχετικού Προγράμματος