Διερεύνηση μοριακών μηχανισμών άμυνας στο αναπαραγωγικό σύστημα των πτηνών

Abstract

Health and disease prevention of livestock are among the major aspects whichconfigure the production costs and the quality of animal derived products. Worldwidetrend in animal production is the support of the defense mechanisms in livestock inorder to prevent microbial pathogens and zoonoses of being incorporated in animalproducts, such as milk, meat and eggs. Thus, knowledge of the endogenousmechanisms of the innate immune system, functioning in the reproductive tract ofmale and female species, protecting naturally from microbial colonization, is crucial.Although the reproductive and immunological systems are distinct,interactions between these two systems have important consequences for fertility andreproductive health in general. During the last years, there is growing evidence thatthese interactions include the families of Toll-like receptors (TLRs), antimicrobialpeptides, such as members of the β-defensins family, as well as cytokines, for whichapart from their roles in innate immunity, it has been reported that they haveimportant roles in various aspects of reproductive physiology.It is well established that prevention of infections is a major aspect ofreproductive physiology, as pathogenic invasion and colonization can have importantconsequences for the health of reproductive organs, leading to impaired fertility andthe risk of microbial pathogens being incorporated into the meat, or into the newlyformed eggs. In the poultry industry a major problem regarding consumption ofpoultry products regards the transmission of zoonoses. Salmonellosis is consider oneof the most frequent zoonoses, and is usually associated with the consumption ofcontaminated poultry meat or eggs.As research on antimicrobial protection of reproductive organs is becoming arapidly emerging area of reproductive physiology the objectives of this study were to determine the expression pattern of TLRs, AvβDs and cytokines in the chicken ovary,oviduct, testis, epididymis and Sertoli cells, as well as in chicken embryos duringearly stages of embryonic development. Furthermore, in the current study the effectsof aging and Salmonella infection in the expression levels of these genes wasinvestigated, as well as the effects of lipopolysaccharide (LPS) in in vitro cultures ofSertoli cells. For these studies, RNA extraction was performed in the ovary, oviduct,testis and epididymis of healthy male and female birds aged between 12, 26, 52 and104 weeks (n = 5 for each age group), from Salmonella Enteritidis (SE) infected maleand female birds, aged 28 and 104 weeks (n = 5 for each age group), from roosterSertoli cells cultured in vitro, as well as from chicken embryos during the early stagesof chicken embryogenesis.The results of these studies revealed that 9 members of the chicken TLRfamily were expressed in the rooster testis and epididymis, while all 10 TLRs wereexpressed in the Sertoli cells. Furthermore, RT-PCR analysis revealed that 11 genesof the AvβD family were expressed in the oviduct, 9 genes were expressed in thetestis and Sertoli cells and 10 genes in the epididymis. Regarding cytokines,expression analysis data revealed that 9 cytokines were expressed in the chickenembryos, 12 genes in the ovary, 11 genes in the oviduct and epididymis, 10 genes inthe testis and 8 genes in Sertoli cells.Quantification of expression levels of these genes during reproductive aging,performed using Real-Time PCR, revealed a significant (P<0.05) up-regulation in theexpression levels of 8 cytokines in the ovary and in 5 AvβDs and 6 cytokine genes inthe oviduct. In the rosters, reproductive aging resulted in a significant (P<0.05)increase of mRNA abundance for 5 TLRs, 2 AvβDs and 6 cytokines in the testis, aswell as for 4 AvβDs and one cytokine in the epididymis. Furthermore, a significant (P<0.05) down-regulation of one cytokine in the ovary, one AvβD gene and onecytokine in the oviduct, 1 TLR, 4 AvβDs and 2 cytokines in the testis, as well as 4TLRs, one AvβD and 7 cytokines in the epididymis were also observed.In vivo Salmonella infection resulted in the ovary in a significant (P<0.05) upregulationof the expression levels of 6 cytokines in the mature and 5 cytokines in theaged birds. Furthermore, SE infection resulted in a significant (P<0.05) induction inthe oviduct in the expression of 7 cytokines and 6 AvβDs in the mature and 3cytokines and 2 AvβDs in aged birds. Regarding roosters, in vivo SE infectionrevealed a significant (P<0.05) up-regulation of 4 AvβDs, 5 TLRs and 5 cytokines,and a decrease in the expression levels of one TLR gene in the testis, as well as asignificant (P<0.05) up-regulation of 4 AvβDs, 6 TLRs and 5 cytokines in theepididymis.Finally, in vitro incubation of LPS in the Sertoli cells, resulted in a significant(P<0.05) up-regulation of the mRNA levels of 6 TLR, 6 AvβD and 4 cytokines, aswell as a significant (P<0.05) down-regulation of 2 cytokines.In conclusion, the collective data from these in vivo and in vitro studiesprovide novel information on the roles of innate immune related genes, such as TLRs,AvβDs and cytokines in the protection of the avian reproductive tract fromSalmonella colonisation and infection. With the restricted use of antibiotics inagriculture, studies regarding the function of peptides and proteins with antimicrobialactivity will provide increased knowledge of the natural endogenous host systemwhich, in future, could be enhanced and/or manipulated thus helping to reduce thetransmission of pathogens to humans via contaminated poultry and poultry products.

Η υγεία και η πρόληψη των ασθενειών των εκτρεφόµενων ζώων αποτελούναπό τους σηµαντικότερους παράγοντες, οι οποίοι διαµορφώνουν το κόστοςπαραγωγής και την ποιότητα των προϊόντων ζωικής προέλευσης. Παγκόσµια τάσηστη ζωική παραγωγή είναι η πρόληψη των ασθενειών και η ενίσχυση της άµυνας τουζωικού οργανισµού µε στόχο την αποφυγή µετάδοσης παθογόνων µικροοργανισµώνκαι τροφιµογενών λοιµώξεων από τα παραγόµενα κτηνοτροφικά προϊόντα στονάνθρωπο. Εποµένως, η γνώση των ενδογενών µηχανισµών του έµφυτουανοσοποιητικού συστήµατος, που λειτουργούν στην αναπαραγωγωγική οδό τωναρσενικών και θηλυκών ορνίθων, προστατεύοντας, από τον µικροβιακό αποικισµό,τη µόλυνση και τη µετάδοση παθογόνων µε φυσικό τρόπο, µειώνοντας τηνπιθανότητα της µετάδοσης λοιµώξεων στον άνθρωπο από µολυσµένα αυγά καικρέατα όρνιθας, κρίνεται απαραίτητη.Το αναπαραγωγικό και το ανοσοποιητικό σύστηµα αν και διαχωρίζονταιλειτουργικά, υφίστανται πολύπλοκες διασυνδέσεις και αλληλεπιδράσεις µεταξύ τους,οι οποίες έχουν σηµαντικές συνέπειες στη γονιµότητα και τη φυσιολογίααναπαραγωγής. Επίσης, την τελευταία δεκαετία υπάρχουν ολοένα και περισσότερεςενδείξεις ότι σε πολλές από αυτές τις αλληλεπιδράσεις εµπλέκονται οι οικογένειεςτων Toll-like υποδοχέων (TLRs), των αντιµικροβιακών πεπτιδίων, όπως είναι ταµέλη της οικογένειας των β-defensins καθώς και των κυτταροκινών, για τις οποίες,εκτός από το ρόλο τους στην έµφυτη ανοσία των αναπαραγωγικών οργάνων, έχειαναφερθεί ότι διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο σε διάφορες πτυχές της φυσιολογίαςαναπαραγωγής.Είναι γνωστό ότι η προστασία από µολύνσεις αποτελεί µία πολύ σηµαντική παράµετρο της φυσιολογικής λειτουργίας του αναπαραγωγικού συστήµατος, καθώς ηεισβολή των µικροβιακών παθογόνων αποτελεί απειλή για την υγεία τωναναπαραγωγικών οργάνων που έχει ως συνέπεια τη µείωση της γονιµότητας καιαποτελεί κίνδυνο για την πιθανή ενσωµάτωση των µικροβιακών παθογόνων στοκρέας και στα νεοσχηµατιζόµενα αυγά. Στον κλάδο της πτηνοτροφίας, ένασηµαντικό πρόβληµα που σχετίζεται µε την κατανάλωση πτηνοτροφικών προιόντων,αφορά στις µεταδιδόµενες στον ανθρώπινο οργανισµό τροφιµογενείς λοιµώξεις. Ησαλµονέλλωση είναι ένα µία τις πιο συχνά αναφερόµενες τροφιµογενείς ασθένειες σεόλο τον κόσµο.Δεδοµένης της σηµασίας των TLRs, των AvβDs και των κυτταροκινών στηνέµφυτη ανοσία και τη φυσιολογία αναπαραγωγής, σκοπός της παρούσας διατριβήςήταν να µελετηθεί το πρότυπο έκφρασης των παραπάνω γονιδίων στην ωοθήκη, τονωαγωγό, τους όρχεις, την επιδιδυµίδα και τα κύτταρα Sertoli, καθώς και σε έµβρυαόρνιθας σε διάφορα στάδια της εµβρυικής ανάπτυξης. Επίσης, στην παρούσαδιατριβή διερευνήθηκε η επίδραση της αναπαραγωγικής ηλικίας στα επίπεδα τηςέκφρασης των TLRs, των AvβDs και των κυτταροκινών στα παραπάνωαναπαραγωγικά όργανα και προσδιορίστηκαν τόσο οι επιπτώσεις της µόλυνσης µεσαλµονέλα των αναπαραγωγικών οργάνων στην έκφραση των παραπάνω γονιδίων,όσο και η επίδραση της επώασης µε LPS στα επίπεδα της έκφρασής τους, σε in vitroκαλλιέργειες κυττάρων Sertoli. Για την υλοποίηση αυτών των πειραµάτων,πραγµατοποιήθηκε αποµόνωση RNA από τους όρχεις, τις επιδιδυµίδες, τις ωοθήκεςκαι τους ωαγωγούς, αρσενικών και θηλυκών ορνίθων ηλικίας 12, 26, 52 και 104εβδοµάδων (n = 5 σε κάθε ηλικία) και από τα µολυσµένα µε Salmonella Enteritidisαρσενικά και θηλυκά ορνίθια, ηλικίας 28 και 104 εβδοµάδων (n = 5 σε κάθε ηλικία), καθώς επίσης και από in vitro καλλιέργειες κυττάρων Sertoli και από έµβρυα σταπρώτα στάδια της εµβρυικής ανάπτυξης.Τα αποτελέσµατα της παρούσης διατριβής έδειξαν ότι για την οικογένεια τωνTLRs, 9 γονίδια εκφράζονται στους όρχεις και στην επιδιδυµίδα, ενώ και τα 10γονίδια της οικογένειας των TLRs εκφράζονται στα κύτταρα Sertoli. Σχετικά µε τηνοικογένεια των αντιµικροβιακών πεπτιδίων AvβDs, από τα πειράµατα έκφρασηςπροέκυψε ότι 11 µέλη εκφράζονται στον ωαγωγό, 9 στους όρχεις, 10 στηνεπιδιδυµίδα και 9 στα κύτταρα Sertoli. Τέλος, όσον αφορά στις κυτταροκίνες,διαπιστώθηκε ότι 9 γονίδια εκφράζονται στα έµβρυα, κατά τα πρώτα στάδια τηςεµβρυικής ανάπτυξης, 12 γονίδια στην ωοθήκη, 11 στον ωαγωγό, 10 στους όρχεις, 11στην επιδιδυµίδα και 8 στα κύτταρα Sertoli.Από τα πειράµατα προσδιορισµού των επιπέδων έκφρασης κατά τη διάρκειατης αύξησης της αναπαραγωγικής ηλικίας, παρατηρήθηκε σηµαντική (P<0.05)αύξηση των επιπέδων έκφρασης σε 8 κυτταροκίνες στην ωοθήκη, σε 5 AvβDs και 6κυτταροκίνες στον ωαγωγό. Στα αρσενικά εντοπίστηκε σηµαντική (P<0.05) αύξησητων επιπέδων έκφρασης σε 5 TLRs, 2 AvβDs και 6 κυτταροκίνες στους όρχεις καθώςκαι 4 AvβDs και µιας κυτταροκίνης στην επιδιδυµίδα. Επίσης, παρατηρήθηκεσηµαντική (P<0.05) µείωση µιας κυτταροκίνης στην ωοθήκη, ενός AvβD και µιαςκυτταροκίνης στον ωαγωγό, 1 TLR, 4 AvβDs και 2 κυτταροκινών στους όρχειςκαθώς και 4 TLRs, ενός AvβD και 7 κυτταροκινών στην επιδιδυµίδα.Η in vivo µόλυνση µε σαλµονέλα, οδήγησε σε σηµαντική (P<0.05) αύξησηστην ωοθήκη των επιπέδων έκφρασης 6 κυτταροκινών στα αναπαραγωγικά ώριµα και5 κυτταροκινών στα αναπαραγωγικά γερασµένα πτηνά. Επίσης, η µόλυνση επέφερεστον ωαγωγό σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων έκφρασης 6 AvβDs στααναπαραγωγικά ώριµα και 2 AvβDs στα αναπαραγωγικά γερασµένα ορνίθια, καθώς και 7 κυτταροκινών στα αναπαραγωγικά ώριµα και 3 κυτταροκινών στααναπαραγωγικά γερασµένα θηλυκά. Όσον αφορά στα αρσενικά, η in vivo µόλυνση µεσαλµονέλα, οδήγησε σε σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων έκφρασης 4AvβDs, 5 TLRs και 5 κυτταροκινών, καθώς και µείωση ενός TLR στους όρχεις.Επιπλέον, στην επιδιδυµίδα παρατηρήθηκε σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδωνέκφρασης 4 AvβDs, 6 TLRs και 5 κυτταροκινών.Τέλος, η in vitro επώαση των κυττάρων Sertoli µε λιποπολυσακχαρίτηοδήγησε σε στατιστικά σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων έκφρασης 6 TLR,6 AvβD και 4 κυτταροκινών, καθώς και σε σηµαντική (P<0.05) µείωση 2κυτταροκινών.Τα συνολικά αποτελέσµατα της έρευνας αυτής παρέχουν πληροφορίες, όσοναφορά στο ρόλο που διαδραµατίζουν τόσο στα αναπαραγωγικά όργανα της όρνιθας,όσο και σε in vitro καλλιέργειες κυττάρων Sertoli, τα µέλη των TLRs, AvβDs και τωνκυτταροκινών. Με τους περιορισµούς στη χρήση αντιβιοτικών στην κτηνοτροφία οιέρευνες που βασίζονται στον τρόπο δράσης αντιµικροβιακών πρωτεινών καιπεπτιδίων θα προωθήσουν και θα αυξήσουν σηµαντικά τη γνώση των φυσικώνενδογενών συστηµάτων εναντίον παθογόνων, τα οποία µελλοντικά µπορούν ναενισχυθούν, βοηθώντας µε τον τρόπο αυτό, στη µείωση της µετάδοσης παθογόνωνµικροοργανισµών στον άνθρωπο από την κατανάλωση µολυσµένων αυγών καιορνίθειου κρέατος.