Έλεγχος απόδοσης συστημάτων μεταφοράς αντιγόνων: κυτταρική στόχευση και λειτουργική διαφοροποίηση

Abstract

Visceral leishmaniasis (VL), caused by Leishmania (L.) donovani and L. infantum parasites, provokes immunosuppression and is fatal, if left untreated. Since chemotherapy has many disadvantages, the development of a highly prophylactic and safe vaccine is considered as the main way to control VL. The aim of this study was the identification of new antigenic proteins through an immunoproteomic approach and the design of chimeric peptides from immunogenic L. infantum proteins for encapsulation in PLGA nanoparticles and in vitro evaluation of their effect on maturation and functional differentiation of dendritic cells (DCs), in an attempt to investigate their use in the development of an experimental vaccine able to elicit CD8(+) T cellular responses. L. infantum proteins were analyzed by 2DE and a comparative study of the reactivity pattern using sera from asymptomatic and symptomatic dogs was conducted after Western blotting. Immunoproteomic analysis revealed 21 proteins (most of them participating in energy metabolism, protein synthesis and stress response) that could be used as antigens in vaccine development since they were recognized specifically by antibodies of asymptomatic dogs, characterized by protection against the disease. Further, three L. infantum proteins (CPA, histone H1, KMP-11) with protective role against VL, were analyzed in silico for the prediction of binding epitopes to HLA class I and class II molecules. Peptides were designed in a way that each peptide included at least one HLA class I-restricted epitope scored very high, as well as adjacent or overlapping HLA class II-restricted epitopes. The experimental validation of their immunogenicity in BALB/c mice formed the basis for the design of longer peptides with the use of appropriate linkers. For each protein, a chimeric peptide was designed and encapsulated in PLGA nanoparticles alone or in combination with MPLA or surface modification with an octapeptide (p8) mimicking the TNFα docking region with TNFRII. The in vitro evaluation was conducted using DCs from transgenic mice expressing an interspecies hybrid MHC class I gene with the alpha-1 and alpha-2 domains of the human HLA-A2.1. Encapsulation of chimeric peptides in PLGA nanoparticles resulted in a significant increase in the number of DCs expressing CD40, CD80, CD86, MHC class I and MHC class II molecules, in comparison to DCs pulsed with soluble peptides. MPLA incorporation, as well as surface modification with p8 further increased maturation, with a significant increase in the number of DCs expressing the hybrid HLA-A2.1, confirming the successful design of chimeric peptides. DCs pulsed in vitro with a mixture of p8-modified multifunctional PLGA nanoparticles or a mixture of multifunctional PLGA nanoparticles with co-encapsulated MPLA induced strong T cell priming and polarization to CD4(+) ΤΗ1 and CD8(+) Τc cell subsets. In conclusion, the above nanoformulations were proved suitable candidates for the development of an experimental vaccine against VL, and the cellular system used could be considered as a useful tool for the in vitro screening of candidate vaccine subunits contributing to the reduction of animal use in preclinical studies.

Η σπλαγχνική λεϊσμανίαση οφείλεται στα στελέχη Leishmania (L.) donovani και L. infantum, προκαλεί ανοσοκαταστολή και είναι θανατηφόρος, αν δε χορηγηθεί θεραπεία. Λόγω των μειονεκτημάτων της χρήσης χημειοθεραπευτικών παραγόντων, η παρασκευή ενός ασφαλούς και αποτελεσματικού εμβολίου θεωρείται ως ο καταλληλότερος τρόπος ελέγχου του νοσήματος. Σκοπός της μελέτης ήταν η αναζήτηση νέων αντιγονικών πρωτεϊνών με ανοσοπρωτεομική και ο σχεδιασμός χιμαιρικών πεπτιδίων ανοσογονικών πρωτεϊνών του στελέχους L. infantum, προκειμένου να εγκλεισθούν σε νανοσωματίδια PLGA και να μελετηθεί in vitro η επίδρασή τους στην ωρίμανση και τη λειτουργική διαφοροποίηση δενδριτικών κυττάρων (ΔΚ), για την ανάπτυξη ενός πειραματικού εμβολίου που στοχεύει σε CD8(+) T κυτταρικές αποκρίσεις. Οι πρωτεΐνες του παρασίτου διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων και μελετήθηκε το πρότυπο αναγνώρισής τους από αντισώματα ασυμπτωματικών και συμπτωματικών μολυσμένων με L. infantum σκύλων, μετά από ανάλυση Western. Προσδιορίστηκαν 21 πρωτεΐνες (οι περισσότερες συμμετέχουν στο μεταβολισμό, την πρωτεϊνοσύνθεση και την απόκριση του παρασίτου στην κυτταρική καταπόνηση) που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως υποψήφια αντιγόνα στο σχεδιασμό εμβολίων, καθώς αναγνωρίστηκαν αποκλειστικά από αντισώματα ασυμπτωματικών σκύλων, οι οποίοι αναπτύσσουν ανοσία. Ακολούθως, τρεις πρωτεΐνες (CPA, ιστόνη H1, KMP-11) με αποδεδειγμένο προστατευτικό ρόλο έναντι του νοσήματος αναλύθηκαν αλγοριθμικά και προσδιορίστηκαν Τ κυτταρικοί επίτοποι που συνδέονται με μόρια HLA τάξης Ι και ΙΙ. Σχεδιάστηκαν πεπτίδια που περιλαμβάνουν ένα τουλάχιστον Τ κυτταρικό επίτοπο με υψηλή συγγένεια σύνδεσης με μόρια HLA τάξης Ι και γειτονικούς ή επικαλυπτόμενους Τ κυτταρικούς επιτόπους με συγγένεια σύνδεσης με μόρια HLA τάξης ΙΙ. Ύστερα από πειραματική επιβεβαίωση της ανοσογονικότητάς τους σε BALB/c ποντικούς, χρησιμοποιήθηκαν για το σχεδιασμό μεγαλύτερων σε μήκος πεπτιδίων, με τη βοήθεια αμινοξικών αλληλουχιών σύνδεσης. Για κάθε πρωτεΐνη, σχεδιάστηκε ένα χιμαιρικό πεπτίδιο και ενσωματώθηκε σε νανοσωματίδια PLGA σε συνδυασμό ή όχι με MPLA ή επιφανειακή τροποποίηση με ένα οκταπεπτίδιο, που προσομοιάζει στην περιοχή σύνδεσης του TNFα με τον υποδοχέα TNFRII. Η in vitro αξιολόγηση των συνθέσεων πραγματοποιήθηκε σε ΔΚ διαγονιδιακών ποντικών, που εκθέτουν στα κύτταρα τους ένα υβριδικό μόριο MHC τάξης Ι με α1 και α2 επικράτειες όμοιες του ανθρώπινου μορίου HLA-A2.1. Ο εγκλεισμός των χιμαιρικών πεπτιδίων σε νανοσωματίδια PLGA ενίσχυσε την ωρίμανση των ΔΚ [αύξηση του ποσοστού των CD40(+), CD80(+), CD86(+), MHC τάξης Ι(+) και ΙΙ(+)] συγκριτικά με τα επίπεδα ωρίμανσης ύστερα από διέγερση με τα πεπτίδια σε διαλυτή μορφή. Η συνδυαστική χρήση του MPLA και η επιφανειακή τροποποίηση ενίσχυσε περαιτέρω την ωρίμανση, με ιδιαίτερα σημαντική αύξηση στο ποσοστό των HLA τάξης Ι(+) ΔΚ που επιβεβαίωσε τον ορθό σχεδιασμό των χιμαιρικών πεπτιδίων. ΔΚ ευαισθητοποιημένα με μείγμα των πολυλειτουργικών νανοφορέων PLGA που έφεραν MPLA ή μείγμα των επιφανειακά τροποποιημένων πολυλειτουργικών νανοφορέων PLGA διαφοροποιήθηκαν λειτουργικά και αποδείχθηκαν ικανά να παρουσιάζουν αντιγόνα σε φυσιολογικά T κύτταρα, οδηγώντας σε ενεργοποίηση CD4(+) ΤΗ1 και CD8(+) Τc κυτταρικών κλώνων. Συμπερασματικά, επιβεβαιώθηκε η καταλληλότητα χρήσης των συγκεκριμένων πολυλειτουργικών νανοφορέων σε πειραματικά πρωτόκολλα εμβολιασμού έναντι της σπλαγχνικής λεϊσμανίασης, ενώ το in vitro κυτταρικό σύστημα που χρησιμοποιήθηκε αποδείχθηκε κατάλληλο για τη διαλογή συστατικών εμβολίων συμβάλλοντας στη μείωση της χρήσης ζώων εργαστηρίου στον προκλινικό έλεγχο.