Nanocarriers with tunable mucus penetration and release properties for controlled delivery of biomolecules

Abstract

Τhis doctoral thesis involves a study on novel drug delivery systems, capable of overcoming the significant barriers associated with the oral route of administration. More specifically, the synthesis of mucus permeating nanoparticulate drug delivery systems, able to surmount the mucus barrier and release their drug payload at the intended site of action is the main scope of this work.Mucus is a heterogeneous membrane secreted either by goblet cells in the epithelium or by submucosal glands. It has a dual capacity to allow the entry of nutrients, but hinder the diffusion of ultrafine particles or pathogens, protecting this way the underlying epithelia. Mucus also bears a lubricative and antimicrobial role and contributes towards the maintenance of water balance in the cell surface. The protective capability of mucus poses, however, another obstacle to the oral delivery of biopharmaceutics, as its ability to selectively entrap foreign entities may lead to the immobilization of drug delivery vehicles, significantly reducing their efficacy.In this context, “slippery” nanocarriers were prepared, able to penetrate the mucus layer by mimicking certain viruses capable of diffusing through mucus with rates comparable to those in water. Polyelectrolyte complexes (PECs) seem to be an interesting approach and therefore appropriate excipients were carefully selected and the influence of various parameters (e.g., pH, mixing order, mass ratio, etc.) on the physicochemical properties of the complexes was evaluated. Extensive characterization of the complexes was effected with respect to their physicochemical properties, in vitro cytotoxicity, mucus permeability and stability. Therapeutics biomolecules (e.g., insulin, PEP356 and Bovine Serum Albumin) were successfully incorporated in PECs, which were accordingly characterized with respect to their drug loading and release. The results demonstrated that PECs can efficiently permeate mucus and release their drug payload in a specific manner at the intended site of action. Another important feature is the ability to effectively tune their physicochemical properties by simply varying certain process parameters.In addition, functionalized poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles were synthesized. Surface functionalization with certain oligopeptide sequences renders the particle surface more hydrophilic, facilitating mucus permeation. The covalently attached sequences represent a substrate for certain proteases and as a result nanoparticles can diffuse through mucus due to their negative net charge and be subsequently endocytosed due to the positive charge obtained after the cleavage of their side chains by brush border proteases. Oligoglutamic acid moieties were covalently attached to the carboxyl groups of PLGA via a carbodiimide-mediated reaction and functional nanoparticles were prepared by the double emulsion method. The characterization of the particles included particle size and zeta potential measurements, evaluation of the in vitro cytotoxicity and in vitro mucus permeability as well as evaluation of the ability of nanoparticles to invert their zeta potential. Higher mucus permeation rates were achieved compared to unmodified PLGA nanoparticles, indicating that surface hydrophilicity plays a major role in diffusion through mucus. A zeta potential inversion was also effected, indicating the successful development of a novel method to effectively modulate the surface charge of the particle.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιείται η σύνθεση καινοτόμων συστημάτων μεταφοράς φαρμάκων, τα οποία παρουσιάζουν αυξημένη ικανότητα διαπέρασης των διάφορων βιολογικών και φυσικών εμποδίων (π.χ. ενζυματικά καταλυόμενη όξινη υδρόλυση στο γαστρικό περιβάλλον, δράση πρωτεολυτικών ενζύμων στο λεπτό έντερο, καθώς και το φυσικό εμπόδιο του βλεννογόνου) που δυσχεραίνουν τη στοματική χορήγηση θεραπευτικών βιομορίων, οδηγώντας σε μειωμένα ποσοστά βιοδιαθεσιμότητας. Πιο συγκεκριμένα, οι νανοδομημένοι αυτοί φορείς κατορθώνουν να διαπερνούν τη βλέννα, απελευθερώνοντας το φαρμακευτικό τους φορτίο με ελεγχόμενο και εκλεκτικό τρόπο στο σημείο που απαιτείται.Η βλέννα εκκρίνεται από καλυκοειδή κύτταρα στο επιθήλιο καθώς και από υποβλεννογόνιους αδένες και φέρει διττό ρόλο, επιτρέποντας αφενός τη διέλευση θρεπτικών συστατικών στην περικυττάρια περιοχή, αποτρέποντας ωστόσο την είσοδο παθογόνων μικροοργανισμών και νανοσωματιδίων. Επιπλέον, φέρει λιπαντικό ρόλο, ενώ συντελεί και στη διατήρηση της υγρασίας στην επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων. Η προστατευτική της ικανότητα αποτελεί ταυτόχρονα και ανεπιθύμητο χαρακτηριστικό, καθώς πέρα από παθογόνους μικροοργανισμούς αποτρέπει και τη διέλευση θεραπευτικών βιομορίων, καθιστώντας αδύνατη την από του στόματος χορήγησή τους.Για την υπέρβαση του φυσικού φραγμού της βλέννας πραγματοποιήθηκε η παρασκευή «ολισθηρών» νανοφορέων, οι οποίοι διαχέονται στη βλέννα μιμούμενοι διάφορους ιούς που κινούνται στη βλέννα με ρυθμό όμοιο με αυτόν στο νερό. Τα σύμπλοκα πολυηλεκτρολυτών παρουσιάζουν επιθυμητά χαρακτηριστικά προς αυτή την κατεύθυνση και για το λόγο αυτό διεξήχθη η προσεκτική επιλογή των κατάλληλων πολυηλεκτρολυτών, ενώ ακολούθως μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων παραμέτρων (λ.χ. pH, σειρά ανάμιξης, λόγος μαζών/φορτίων, κ.α.) στη διαδικασία παρασκευής των συμπλόκων. Ακολούθησε εκτενής χαρακτηρισμός των συμπλόκων ως προς τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες, την κυτταροτοξικότητά τους, την ικανότητά τους να διαπερνούν τη βλέννα, καθώς και τη σταθερότητά τους. Ακολούθως, επετεύχθη η σύζευξη πρωτεϊνικών φαρμάκων (λ.χ. ινσουλίνης, PEP356 καθώς και αλβουμίνης βόειου ορού) στα σύμπλοκα αυτά και μελετήθηκε ο ρυθμός αποδέσμευσης των βιομορίων. Διαπιστώθηκε ότι ο μηχανισμός της αποδέσμευσης των βιομορίων οδηγεί στην τοπικά εκλεκτική απελευθέρωσή του, συντελώντας στην τοπική μόνο απελευθέρωση του βιομορίου στην επιθυμητή περιοχή. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων υποδεικνύει την επιτυχή σύνθεση συμπλόκων πολυηλεκτρολυτών με κατάλληλες ιδιότητες και αυξημένη ικανότητα διαπέρασης των βλεννωδών μεμβρανών ενώ η ικανότητα τροποποίησης των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των σωματιδίων κατά το δοκούν οδηγεί σε σωματίδια ικανά να εξυπηρετούν πληθώρα εφαρμογών.Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση λειτουργικών νανοσωματιδίων πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος (PLGA), το οποίο φέρει ομοιοπολικά συζευγμένες πεπτιδικές ακολουθίες που αφενός το καθιστούν πιο υδρόφιλο, διευκολύνοντας έτσι την κίνησή του εντός του δικτύου της βλέννας κι αφετέρου αποτελούν υπόστρωμα πρωτεασών που απαντούν στην ψυκτροειδή παρυφή των επιθηλιακών κυττάρων. Η ενζυμική σχάση των πεπτιδικών αυτών ακολουθιών οδηγεί στην αλλαγή του ζ-δυναμικού του σωματιδίου από αρνητικό σε θετικό, αυξάνοντας με αυτόν τον τρόπο την ικανότητα ενδοκυττάρωσης των σωματιδίων. Σε πρώτο στάδιο πραγματοποιήθηκε η σύζευξη του πεπτιδίου στο πολυμερές PLGA μέσω της αντίδρασης του καρβοδιιμιδίου και εν συνεχεία η παρασκευή λειτουργικών νανοσωματιδίων με τη μέθοδο του διπλού γαλακτώματος. Ακολούθησε ο πλήρης φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των σωματιδίων, ενώ επίσης μελετήθηκαν η κυτταροτοξικότητα και η ικανότητα διάχυσής τους στη βλέννα. Τέλος, διερευνήθηκε και η in vitro ικανότητα των σωματιδίων να μεταβάλλουν το ζ-δυναμικό τους από αρνητικό σε θετικό μετά την ενζυμική σχάση των πλευρικών αλυσίδων που φέρουν.