Ενέσιμες υδροπηκτές με βάση το υαλουρονικό οξύ για επιδιόρθωση του αρθρικού χόνδρου

Abstract

The purpose of this thesis is to develop injectable hydrogels based on hyaluronic acid, a natural polymer found in the human body, for the repair of cartilage lesions. The existing procedures for the repair of cartilage lesions are invasive and have limitations with respect to geometry and cartilage defect size. Therefore, there is a great need for the development of non-invasive treatments for the repair of small cartilage injuries. In this context, the development of injectable methacrylated hyaluronic acid (MeHA) hydrogels, synthesized using two different crosslinking methods, has been effected. In particular, a redox initiation system of ammonium persulfate (APS) and N,N,N,N΄- tetramethylenediamine (TEMED), and a matrix metalloproteinase 7 (MMP7)-sensitive peptide were effectively used for the formation of MeHA based hydrogels. During this study, the influence of the molecular weight of HA, degree of methacrylation (DM), and biofunctionalization of MeHA using a chondroitin sulfate (CS) binding peptide, was experimentally assessed. Concerning the use of the MMP7-degradable peptide as crosslinker, it was observed that, as the concentration of the peptide crosslinker increased, the gelation onset time and the degradation rate of the synthesized hydrogels were decreased, while their storage modulus (G′) increased. The use of CS-MeHA as a functional macromer resulted in a retardation of the gelation onset and the formation of softer hydrogels. Finally, the crosslinking reaction in cell growth medium was shown to increase the G’ of the formed hydrogel to values that could favor the differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs) to chondrocytes. The successful development of injectable MeHA hydrogels using an MMP7-degradable peptide as crosslinker was followed by their embedding with a low concentration of either human mesenchymal stem cells (hMSCs) or chondrocytes. hMSC-laden MeHA and CS-MeHA hydrogels were cultured either in stem cell medium (SCM) or chondrogenic medium (CiM), and assessed regarding their ability to promote the differentiation of hMSCs towards a chondrogenic and/or hypertrophic phenotype, as well as to maintain the viability of the encapsulated cells. The developed MeHA and CS-MeHA hydrogels appeared to provide a proper environment for the growth and proliferation of hMSCs. This was enhanced in the case of CS-MeHA hydrogels showing the positive effect of the chondroitin sulfate binding peptide on the chondrogenic differentiation of hMSCs. However, the use of chondrogenic medium was considered necessary in order to obtain full-span chondrogenesis. Finally, the chondrocyte-laden MeHA hydrogels were cultured in an ex vivo osteochondral platform and assessed regarding their ability to form cartilage extracellular matrix. Distribution of glycosaminoglycans and development of chondrocyte clusters in isogenous groups, characteristic of hyaline cartilage morphology, were observed on the fourteenth day of the ex vivo culture.

Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη ενέσιμων υδροπηκτών με βάση το υαλουρονικό οξύ για την επιδιόρθωση χόνδρινων ατελειών. Οι ήδη υπάρχουσες τεχνικές για τη θεραπεία χόνδρινων ατελειών είναι επεμβατικές και παρουσιάζουν περιορισμούς σχετικά με τη γεωμετρία και το μέγεθος του τραύματος. Επομένως, υπάρχει μεγάλη ανάγκη για την ανάπτυξη μη επεμβατικών θεραπειών με βάση τις αρχές της μηχανικής ιστών. Βάσει των παραπάνω, μελετήθηκε η ανάπτυξη ενέσιμων υδροπηκτών μεθακρυλιωμένου υαλουρονικού οξέος (MeHA), που συντέθηκαν με δύο διαφορετικές μεθόδους δικτύωσης. Πιο συγκεριμένα, ένα σύστημα εκκινητών οξείδωσης-αναγωγής υπερθειικού αμμωνίου και Ν,Ν,Ν,Ν’-τετραμεθυλοδιαμίνης και ένα πεπτίδιο που διασπάται ενζυμικά από τη μεταλλοπρωτεϊνάση θεμέλιας ουσίας 7 χρησιμοποιήθηκαν για τον σχηματισμό υδροπηκτών με βάση το μεθακρυλιωμένο υαλουρονικό οξύ. Κατά τη διάρκεια της παρούσας μελέτης αξιολογήθηκε πειραματικά η επίδραση του μοριακού βάρους του υαλουρονικού οξέος, του βαθμού μεθακρυλίωσης, και της τροποποίησης του μεθακρυλιωμένου υαλουρονικού οξέος χρησιμοποιώντας ένα πεπτίδιο προσκόλλησης θειικής χονδροϊτίνης (CS), ως προς τις ιδιότητες των υδροπηκτών. Όσον αφορά τη χρήση του πεπτιδίου που διασπάται ενζυμικά από τη μεταλλοπρωτεϊνάση θεμέλιας ουσίας 7 ως μέσο δικτύωσης, παρατηρήθηκε ότι με την αύξηση της συγκέντρωσης του πεπτιδίου, ο χρόνος έναρξης σχηματισμού της υδροπηκτής και ο ρυθμός διάσπασης των συντιθεμένων υδροπηκτών μειώνονται, ενώ το μέτρο αποθήκευσής τους (G’) αυξάνεται. Η χρήση του CS-MeHA ως λειτουργικό μακρομερές είχε ως αποτέλεσμα την καθυστέρηση της έναρξης σχηματισμού των υδροπηκτών και τη δημιουργία μαλακών υδροπηκτών. Τέλος, η αντίδραση δικτύωσης σε θρεπτικό μέσο ανάπτυξης κυττάρων έδειξε ότι το G’ της σχηματιζόμενης υδροπηκτής αυξάνεται σε βαθμό που θα μπορούσε να ευνοήσει τη διαφοροποίηση ανθρώπινων μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (hMSCs) σε χονδροκύτταρα. Την επιτυχή ανάπτυξη ενέσιμων υδροπηκτών με χρήση πεπτιδίου που διασπάται ενζυμικά από τη μεταλλοπρωτεϊνάση θεμέλιας ουσίας 7 ως μέσο δικτύωσης, ακολούθησε η ενσωμάτωση σε αυτές ανθρώπινων μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων, ή χονδροκυττάρων, σε χαμηλή συγκέντρωση. Οι υδροπηκτές MeHA και CS-MeHA, στις οποίες ενσωματώθηκαν hMSCs, καλλιεργήθηκαν είτε σε θρεπτικό μέσο βλαστοκυττάρων είτε σε χονδρογονικό μέσο και εκτιμήθηκαν σχετικά με την ικανότητά τους να προάγουν τη διαφοροποίηση των hMSCs ως προς έναν χονδρογονικό και/ή υπερτροφικό φαινότυπο, καθώς και ως προς την ικανότητά τους να διατηρούν τη βιωσιμότητα των ενσωματωμένων κυττάρων. Παρατηρήθηκε ότι οι υδροπηκτές MeHA και CS-MeHA παρέχουν ένα κατάλληλο περιβάλλον για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των hMSCs. Αύξηση των χονδρογονικών δεικτών παρατηρήθηκε και στην περίπτωση των υδροπηκτών CS-MeHA υποδεικνύοντας τη θετική επίδραση του πεπτιδίου προσκόλλησης θειικής χονδροϊτίνης στη χονδρογονική διαφοροποίηση των hMSCs. Ωστόσο, η χρήση χονδρογονικού μέσου κρίθηκε απαραίτητη για την επίτευξη χονδρογένεσης πλήρους εύρους. Τέλος, υδροπηκτές MeHA, στις οποίες ενσωματώθηκαν χονδροκύτταρα, καλλιεργήθηκαν σε μια ex vivo οστεοχόνδρινη πλατφόρμα και αξιολογήθηκαν σχετικά με την ικανότητά τους να σχηματίζουν χόνδρινη εξωκυττάρια θεμέλια ουσία. Κατά την δέκατη τέταρτη ημέρα της ex vivo καλλιέργειας παρατηρήθηκε κατανομή γλυκοζαμινογλυκανών και ανάπτυξη συστάδων χονδροκυττάρων σε ισογενείς ομάδες τα οποία αποτελούν χαρακτηριστικό της μορφολογίας του υαλώδους χόνδρου.