Διερεύνηση του γενετικού - βιολογικού ρόλου των εισοσωμικών πρωτεϊνών του μύκητα Aspergillus nidulans

Abstract

The plasma membrane is implicated in a variety of functions, whose coordination necessitates highly dynamic organization of its constituents into domains of distinct protein and lipid composition. Eisosomes, at least partially, mediate this lateral plasma membrane compartmentalization. In the model filamentous fungus Aspergillus nidulans, PilA and PilB, two homologues of the Saccharomyces cerevisiae eisosome proteins Pil1/Lsp1, and SurG, a strict orthologue of Sur7, are assembled and form tightly packed structures in conidiospores, products of the asexual cycle. Our results show that core eisosome proteins PilA, PilB and SurG are not expressed in hülle cells or early ascospores, but are expressed in mature ascospores. In mature but quiescent ascospores, PilA forms static punctate structures (foci) at the plasma membrane. PilB also was observed at the ascospore membrane as well, with higher concentration at the areas where the two halves of ascospores are joined together. Finally, SurG was localized both at the membrane of ascospores and perinuclearly. In germlings originating from ascospores the punctate structures along the hypha were shown to be composed only of PilA. PilB is diffused in the cytoplasm and SurG was located in vacuoles, endosomes and in foci in the hyphal head. This localization is identical to that found in germlings originated from conidiospores. In germinated ascospores PilA foci did not colocalise with the highly mobile and transient peripheral punctate structures of AbpA, a marker for sites of clathrinmediated endocytosis. Deletions of each one or all the three core eisosomal genes do not affect viability or germination of ascospores. In the presence of myriocin – a specific inhibitor of sphingolipid biosynthesis – PilA-GFP foci of ascospore germlings were less numerous and their distribution was significantly altered, suggesting a correlation between PilA foci and sphingolipid biosynthesis. Moreover due to the fact that the tetraspan proteinNce102 has been implicated as part of a sensor for sphingolipid homeostasis, the role of Nce102 homologue (AnNce102) in A.nidulans was investigated. We showed that AnNce102 forms stable structures with low mobility that colocalizes with eisosomes and plays a crucial role in density/number of PilA/SurG foci in the head of germlings. In addition we demonstrate that AnNce102 and PilA negatively regulate sphingolipid biosynthesis, since their deletions partially suppress the thermosensitivity of basAmutant encoding sphingolipid C4-hydroxylase and the growth defects observed upon treatment with inhibitors of sphingolipid biosynthesis, myriocin and Aureobasidin A. Moreover, we show that YpkA repression mimics genetic or pharmacological depletion of sphingolipids, conditions that induce the production of Reactive Oxygen Species (ROS) and can be partially overcome by deletion of pilAand/or annce102. Consistent with these findings, pilA∆and annce102∆also show differential sensitivity to various oxidative agents, while AnNce102 overexpression canbypass sphingolipid depletion regarding the PilA/SurG foci number and organization, also leading to the mislocalization of PilA to septa.

Η πλασµατική µεµβράνη εµπλέκεται σε διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες, ο συντονισµός των οποίων απαιτεί τη δυναµική οργάνωση των συστατικών της, σεµεµβρανικές περιοχές διαφορετικής λιπιδικής και πρωτεϊνικής σύστασης. Τα στικτάπρωτεϊνικά συµπλέγµατα που ονοµάζονται εισοσώµατα, τουλάχιστον εν µέρει, συµβάλλουν στη διαµερισµατοποίηση της πλασµατικής µεµβράνης των µυκήτων. Στονηµατοειδή µύκητα Aspergillus(Emericella) nidulans, οι εισοσωµικές πρωτεΐνεςPilA και PilB, οµόλογες των Pil1/Lsp1 του Saccharomyces cerevisiae, και η SurG, οµόλογη της Sur7, συναρµολογούνται και σχηµατίζουν πυκνές στικτές κοκκιώδειςδοµές στα προϊόντα του αφυλετικού κύκλου ζωής του µύκητα, τα κονιδιοσπόριαΣτην παρούσα διδακτορική διατριβή, µελετήθηκε η κατανοµή και η έκφρασητων εισοσωµικών πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια του φυλετικού κύκλο ζωής τουA.nidulans. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι οι κύριες εισοσωµικές πρωτεΐνες, PilA, PilB και SurG δεν εκφράζονται στα κύτταρα hülle ή τα πρώιµα ασκοσπόρια αλλάαντίθετα εκφράζονται στα ώριµα ασκοσπόρια. Σε αδρανή ώριµα ασκοσπόρια, ηπρωτεΐνη PiłΑ σχηµατίζει στατικές στικτές δοµές στην πλασµατική µεµβράνη τωνασκοσπορίων. Παρόµοια, ηPilB εντοπίζεται στην περιφέρεια των ασκοσπορίων αλλάσυγκεντρώνεται κυρίως στις περιοχές όπου τα δύο µισά ενός ασκοσπορίουενώνονται. Τέλος, ηSurG εντοπίζεται τόσο στη µεµβράνη των ασκοσπορίων όσο καιπεριπυρηνικά - ενδοπλασµατικό δίκτυο. Σε εκβλαστηµένα ασκοσπόρια, οι στικτέςδοµές κατά µήκος της υφής αποτελούνται αποκλειστικά από την πρωτεΐνη PilΑ. ΗPilB εντοπίζεται διάχυτη στο κυτταρόπλασµα και ηSurG στοχεύετε στα χυµοτόπια, τα ενδοσώµατα αλλά εντοπίζεται και σε στικτούς κοκκιώδεις σχηµατισµούς στηνκεφαλή των υφών. Η κατανοµή αυτών των πρωτεϊνών είναι πανοµοιότυπη µε αυτήπου βρέθηκε σε νεαρές υφές προερχόµενες από κονιδιοσπόρια. Επιπλέον, σεεκβλαστηµένα ασκοσπόρια οιPiłΑ στικτοί σχηµατισµοί δεν συνεντοπίζονται µε τιςιδιαίτερα κινητικές στικτές δοµές της ΑbpΑ, ενός µάρτυρα ενδοκύττωσης κυστιδίωνκαλυµµένων µε πλέγµα κλαθρίνης. Παρουσία µυριοσίνης – ειδικού αναστολέα τηςβιοσύνθεσης σφιγγολιπιδίων – τα PiłΑ κοκκία των νεαρών υφών που προέρχονταιαπό ασκοσπόρια, είναι λιγότερα σε αριθµό και η τοπολογία τους έχει σηµαντικάαλλοιωθεί, υποδηλώνοντας συσχέτιση µεταξύ της εισοσωµικής PiłΑ και τηςβιοσύνθεσης των σφιγγολιπιδίων. Επιπρόσθετα, καθώς η πρωτεΐνηNce102 του S. cerevisiae έχει προταθεί ότιαποτελεί µέρος ενός αισθητήρα των επίπεδων των σφιγγολιπιδίων, διερευνήθηκε ορόλος της AnNce102 στον A. nidulans. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι η AnNce102 σχηµατίζει σταθερές δοµές µε χαµηλή κινητικότητα που συνεντοπίζονται µε ταεισοσώµατα και διαδραµατίζει καθοριστικό ρόλο στην πυκνότητα/αριθµό τωνPilA/SurG κοκκίων στην κεφαλή νεαρών υφών. Επιπλέον, δείχθηκε ότι οι πρωτεΐνεςAnNce102 και PilA ρυθµίζουν αρνητικά τη βιοσύνθεση σφιγγολιπιδίων, καθώςαπαλοιφές των γονιδίων τους καταστέλλουν µερικώς τη θερµοευαισθησία τουστελέχους basA1, το οποίο κωδικοποιεί για την C4-υδροξυλάση, υπεύθυνη για τηµετατροπή της διϋδροσφιγγοσίνης σε φυτοσφιγγοσίνη. Επιπλέον, απαλοιφές τωνγονιδίων annce102 και pilA καταστέλλουν µερικώς τη µη φυσιολογική ανάπτυξη πουπαρατηρείται µετά από επώαση των κυττάρων µε τους αναστολείς της βιοσύνθεσηςτων σφιγγολιπιδίων, µυριοσίνη και αουρεοβασιδίνη Α. Ταυτόχρονα, δείχθηκε ότιαπενεργοποίηση της κινάσηςYpkA µιµείται τη γενετική ή τη φαρµακολογική µείωσητων σφιγγολιπιδίων, γεγονός, το οποίο υποδεικνύει την άµεση σχέση της κινάσης µετη ρύθµιση του µονοπατιού της βιοσύνθεσης των σφιγγολιπιδίων. Στις ίδιες συνθήκεςπαρατηρήθηκε σηµαντική αύξηση δραστικών µορφών οξυγόνου (∆ΜΟ- ROS), ηοποία µπορούσε εν µέρει να ξεπεραστεί µε την απαλοιφή των γονιδίων pilA καιannce102. Σε συµφωνία µε αυτά τα ευρήµατα, παρατηρήθηκε ευαισθησία ήανθεκτικότητα των annce102∆ ή/και pilA∆ στελεχών σε διαφορετικούς οξειδωτικούςπαράγοντες, ενώ η υπερέκφραση της AnNce102 αποκαθιστά τον αριθµό και τηνοργάνωση των PilA/SurG κοκκίων σε κύτταρα µε διαταραγµένα επίπεδασφιγγολιπιδίων και επιπρόσθετα οδηγεί στον « άτυπο» εντοπισµό τωνPilA κοκκίωνστα διαφράγµατα.