Μελέτη της σχέσης δομή - λειτουργία του κύριου μεταφορέα προλίνης (PrnB) στο μύκητα Aspergillus nidulans

Abstract

The prnB gene of A. nidulans encodes a specific proline transporter. The PrnB transporter is a transmembrane protein consisting of 12 putative transmembrane segments (TMS) connected with small hydrophilic loops (L). The PrnB belongs to the Amino Acid Polyamine Organocation (APC) transporter family. Members of this family are highly conserved in both prokaryotes and eukaryotes. The present study investigates the structure- function relationships of the PrnB protein using genetic, molecular and biochemical approaches. A number of PrnB mutations were isolated either genetically or constructed in vitro by site-directed mutagenesis. Our results show that missense mutations that directly or indirectly affect PrnB function are located in L2-TMS3 (prnB6, prnB144 mutations), TMS6 (prnBKL, prnBKE, prnB119), L6-TMS7 (prnB81), L8-TMS9-L9 (pmB117, prnB206, prnB508) and L10-TMS11 (prnB411) segments of this protein. Of particular importance for PrnB function are amino acid residues K245 and F248 of TMS6 a-helix. K245 is one of the two positively charged amino acids that are located within a transmembrane segment of PrnB, while F248 is strictly conserved in all members of the APC transporter family that are registered in the SWISS- PROT database. Changes of these amino acids significantly affect the kinetics of proline transport. In addition, amino acid residues in the L8-TMS9 segment seem also to be critical for PrnB function. This region corresponds to a functionally important Consensus Amphipathic Region (CAR) identified in bacterial, fungal and mammalian amino acid transporter homologues. Duplications of 2 and 3 amino acids (mutations prnB206 and prnB117) in the above region result in total loss of PrnB function or significant changes in the Km and Vmax values, respectively. Interestingly, similar to the above PrnB domains have been shown to affect the function of other members of the APC transporter family. In conclusion, our results show that mid-TMS6 and L8-TMS9 domains might form part of the polar pathway through which proline moves across the plasma membrane. In order to gain further insights on the structure - function relationships of the PrnB protein and study its cellular localization in vivo, we made use of the Green Fluorescent Protein (GFP) technology. Several prnB - gfp fusions, driven by prnB native promoter sequences, were constructed and targeted to the genomic locus of a prnB null mutant. Chimeric proteins containing GFP fused to the C- terminus of PrnB through a linker of 2, 4 or 8 amino acids, with low potential to form secondary structure elements, were shown to be functional in vivo. Only the 4-linker fusion affords full functionality of the PrnB at 25°C (physiological growth temperature of the fungus). These results show that the number and nature of the linker amino acids is critical for the correct expression and/or translocation of the chimeric molecules to the plasma membrane. In addition, this work demonstrates that the GFP fusion technology is a unique tool with which to study the expression and cellular localization of low abundance transmembrane transporters expressed from their native promoters. Finally, the method used to construct the chimeric molecules allows the fusion of GFP to any prnB' allele, notwithstanding whether this allele is functional or not. This allows the distinction between mutations affecting PrnB translocation from those that directly affect PrnB function.

Το γονίδιο prnB του μύκητα Aspergillus nidulans κωδικοποιεί ένα ειδικό για την προλίνη μεταφορέα. Ο μεταφορέας αυτός είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με κυτταροπλασματικό αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο, που αποτελείται από 12 πιθανά διαμεμβρανικά τμήματα α-έλικας (TMS: Transmembrane segments), τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με μικρές υδρόφιλες θηλειές (L: loops). Η πρωτεΐνη PrnB ανήκει στην οικογένεια μεταφορέων APC (Amino Acid Polyamine Organocation) μέλη της οποίας εντοπίζονται σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν οι σχέσεις δομής-λειτουργίας του μεταφορέα PrnB μέσω της γενετικής, μοριακής και βιοχημικής μελέτης στελεχών του Α. nidulans που εκφράζουν μεταλλαγμένες πρωτεΐνες PrnB. Οι εν λόγω μεταλλαγές είτε απομονώθηκαν γενετικά είτε κατασκευάσθηκαν με in vitro μεταλλαξιγένεση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι παρερμηνεύσιμες μεταλλαγές που επηρεάζουν άμεσα ή έμμεσα τη λειτουργία της πρωτεΐνης PrnB εντοπίζονται στα L2-TMS3 (prnB6, prnB144), TMS6 (prnBKL, prnBKE, prnB119), L6-TMS7 (prnB81), L8-TMS9-L9 (prnB117, prnB206, prnB508) και L10-TMS11 (prnB411) τμήματά της. Από τις παραπάνω μεταλλαγές ιδιαίτερο ρόλο στη λειτουργία της πρωτεΐνης PrnB φαίνεται να διαδραματίζουν τα αμινοξέα Κ245 και F248 του TMS6. Η Κ245 είναι ένα από τα δύο θετικά φορτισμένα αμινοξέα που εντοπίζονται μέσα σε διαμεμβρανικά τμήματα της PrnB ενώ η F248 είναι αυστηρά συντηρημένη σε όλα τα μέλη της οικογένειας APC που είναι καταχωρημένα στην τράπεζα δεδομένων SWISS-PROT. Αλλαγή των αμινοξέων αυτών προκαλεί σημαντική μείωση της χημικής συγγένειας της PrnB για την προλίνη. Επιπλέον, σημαντικό ρόλο στη λειτουργία της PrnB φαίνεται να έχει η περιοχή L8-TMS9, η οποία αντιστοιχεί στη σημαντική για τη λειτουργία μεταφορέων αμινοξέων συναινετική αμφιπαθική περιοχή CAR (Consensus Amphipathic Region). Διπλασιασμός 2 και 3 αμινοξέων στην εν λόγω περιοχή προκαλεί πλήρη απώλεια λειτουργίας και σημαντική μεταβολή των τιμών Km και Vmax της PrnB, αντίστοιχα. Ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός ότι αντίστοιχα με τα παραπάνω τμήματα άλλων μελών της οικογένειας μεταφορέων APC έχει δειχθεί ότι είναι σημαντικά για τη λειτουργία των μεταφορέων αυτών. Εν κατακλείδι, τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι περιοχές TMS6 και L8-TMS9 του μεταφορέα PrnB αποτελούν μέρος της οδού πρόσδεσης ή/και μεταφοράς της προλίνης διαμέσω της κυτταρικής μεμβράνης. Στα πλαίσια εμβάθυνσης των σχέσεων δομής - λειτουργίας του μεταφορέα PrnB καθώς και για τη μελέτη της in vivo τοπογένεσής του χρησιμοποιήθηκε η πρωτεΐνη GFP (Green Fluorescent Protein). Ένας αριθμός χιμαιρικών γονιδίων prnB - gfp κατασκευάσθηκαν, ενσωματώθηκαν στο γενετικό τόπο του γονιδίου prnB, εκφράστηκαν από το φυσιολογικό παρακινητή του, και τα αντίστοιχα χιμαιρικά μόρια PrnB - GFP εντοπίστηκαν in vivo. Τα χιμαιρικά αυτά μόρια φέρουν 2, 4 ή 8 συνδετικά αμινοξέα μεταξύ των πρωτεϊνών PrnB και GFP. Τα εν λόγω αμινοξέα δεν τροποποιούν τη δευτεροταγή δομή των χιμαιρικών μορίων, καθώς επιλέχθηκαν να μην είναι συμβατά με το σχηματισμό στοιχείων δευτεροταγούς δομής. Βρέθηκε ότι μόνο τα χιμαιρικά μόρια με 4 συνδετικά αμινοξέα είναι πλήρως λειτουργικά στους 25°C (φυσιολογική θερμοκρασία ανάπτυξης του μύκητα). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ο αριθμός και το είδος των συνδετικών αμινοξέων μεταξύ των δύο μελών των χιμαιρικών μορίων είναι σημαντικός για τη "φυσιολογική" τοπογένεσή τους στην κυτταρική μεμβράνη. Επιπλέον, η χρήση της πρωτεΐνης GFP για τον in vivo εντοπισμό του διαμεμβρανικού μεταφορέα PrnB είναι δυνατή χωρίς να απαιτείται η υπερέκφραση του τελευταίου. Τέλος, η μέθοδος που αναπτύχθηκε για την κατασκευή χιμαιρικών PrnB-GFP μορίων δίνει τη δυνατότητα ενσωμάτωσης και έκφρασης οποιουδήποτε prnB- αλληλομόρφου. Αυτό έχει ως συνέπεια το διαχωρισμό των μεταλλαγών που επηρεάζουν άμεσα τη λειτουργία της πρωτεΐνης PrnB από αυτές που επηρεάζουν την τοπογένεσή της.