Σχεδιασμός και αξιολόγηση χιμαιρικών νανοσυστημάτων μεταφοράς δοξορουβικίνης με συνδυασμό λιποσωμάτων και υπερδιακλαδισμένων πολυμερών

Abstract

In the past decades, the encapsulation of anticancer active pharmaceutical ingredients in nanocarriers has attracted great research interest. The goal is to improve their therapeutic activity, decrease the adverse effects that result from their activity in healthy tissues and cells, and control their retention time inside the body. However, the developed carriers fail to reach clinical practice due to their inability to fulfill specific requirements (e.g. drug encapsulation efficiency, size, surface charge, surface hydrophilicity etc.).Recently a new class of carriers has emerged, called chimeric carriers. They are produced by the combination of two different nanocarriers, aiming at the improvement of the systems’ properties, such as drug encapsulation efficiency and release rate. Systems produced by the combination of liposomes and dendrimers, named “liposome “locked-in” dendrimers”, belong to this class. In these systems, the incorporation of dendrimers in liposomes increased the encapsulation efficiency of the anticancer drug doxorubicin (DOX) and controlled its release rate. The mechanism through which these actions occur, as well as the interactions that take place between the carriers structural components and result in their ameliorated characteristics, have not been fully explored. The purpose of the present doctoral thesis is the development of a new nanocarrier for anticancer drugs prepared by the combination of liposomes and hyperbranched polymers (HBPs), the in-depth investigation of the interactions that take place between the individual components of the final carrier and the clarification of the parameters that affect its final properties. The aforementioned information can be used later on for the design of such drug delivery carriers and the prediction of their properties. As an active pharmaceutical ingredient, the anticancer drug DOX was chosen and as dendritic polymers, different pseudogeneration of HBPs belonging to the class of aliphatic polyesters were used. For studying both the interactions between liposomes, HBPs and DOX and the properties of the final carriers, advanced analytical techniques were used such as Differential Scanning Calorimetry (m-DSC), Fourier Transform Infrared – Attenuated Total Reflectance Spectroscopy (ATR-FTIR), Pulsed-Gradient Spin Echo-NMR (PGSE-NMR), Atomic Force Microscopy (AFM) and Electron Paramagnetic Resonance (EPR). From these studies the following parameters were determined: (1) the optimum composition of the final carriers (liposome phospholipid composition and percentage of incorporated HPBs depending on their pseudogeneration number), (2) DOX encapsulation efficiency and release rate, (3) interactions between phospholipids, HBPs and DOX that affect drug encapsulation and release as well as the stability of the dug carrier and (4) the effect of other formulation parameters such as the presence of high concentrations of sucrose and osmotic pressure differences either-side of the liposomal lipid bilayer. Finally, HBPs terminal groups were modified (from hydroxyl to carboxyl groups) and the effect of the nature of these groups on drug encapsulation efficiency was investigated.

Τις τελευταίες δεκαετίες ο εγκλωβισμός αντικαρκινικών μορίων σε νανοφορείς έχει προσελκύσει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον με στόχο την ενίσχυση της θεραπευτικής τους δράσης, τη μείωση των ανεπιθύμητων ενεργειών που προκαλούνται από τη δράση τους σε υγιείς ιστούς και κύτταρα και τον έλεγχο του χρόνου κυκλοφορίας τους στον οργανισμό. Εντούτοις, οι αναπτυσσόμενοι φορείς δεν καταφέρνουν να φτάσουν στην κλινική πράξη, καθώς δεν επιτυγχάνεται η εκπλήρωση επιμέρους παραμέτρων (π.χ. ικανότητα εγκλωβισμού του δραστικού μορίου, μέγεθος, φορτίο, υδροφιλία επιφάνειας φορέα, κ.α.). Πρόσφατα έχουν αρχίσει να μελετώνται χιμαιρικοί φορείς που προκύπτουν από το συνδυασμό δύο νανοφορέων με στόχο τη βελτίωση των ιδιοτήτων του τελικού συστήματος, όπως την αύξηση της ικανότητας εγκλωβισμού του δραστικού μορίου ή/και τον έλεγχο της αποδέσμευσης αυτού. Τέτοια χιμαιρικά συστήματα αποτελούν τα συστήματα λιποσωμάτων – δενδριμερών, που χαρακτηρίζονται ως «liposome “locked-in” dendrimers», στα οποία τα ενσωματωμένα στα λιποσώματα δενδριμερή αυξάνουν τον εγκλωβισμό της δοξορουβικίνης (DOX), η οποία είναι γνωστή για την αντικαρκινική της δράση, και τροποποιούν το ρυθμό αποδέσμευσής της. Ο μηχανισμός με τον οποίο επιτυγχάνεται αυτό, αλλά και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των επιμέρους δομικών στοιχείων του τελικού φορέα στις οποίες οφείλονται τα βελτιωμένα χαρακτηριστικά του δεν έχουν διερευνηθεί σε βάθος. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη ενός νέου νανοφορέα αντικαρκινικών μορίων που προκύπτει από το συνδυασμό λιποσωμάτων και υπερδιακλαδισμένων πολυμερών (HBPs), η σε βάθος μελέτη της αλληλεπίδρασης των επιμέρους στοιχείων του συστήματος και η αποσαφήνιση των παραμέτρων που επιδρούν στις τελικές ιδιότητες αντίστοιχων χιμαιρικών συστημάτων. Οι παραπάνω πληροφορίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν έπειτα στο σχεδιασμό και την πρόβλεψη των ιδιοτήτων του τελικού συστήματος. Ως βιοδραστικό μόριο επιλέχθηκε η DOX, ενώ χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές ψευδογενιές HBPs που ανήκουν στην κατηγορία των αλειφατικών πολυεστέρων. Για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των λιποσωμάτων, των HBPs και της DOX αλλά και των ιδιοτήτων των τελικών συστημάτων εφαρμόστηκαν εξελιγμένες αναλυτικές τεχνικές όπως διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (m- DSC), φασματοσκοπία υπέρυθρου εξασθενημένης ολικής ανάκλασης με μετασχηματισμό Fourier (ATR-FTIR), φασματοσκοπία μαγνητικού πυρηνικού συντονισμού βαθμίδωσης παλμών spin echo (PGSE-NMR), μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων (AFM) και φασματοσκοπία ηλεκτρονικού παραμαγνητικού συντονισμού (EPR). Από τις παραπάνω μελέτες προσδιορίστηκε η βέλτιστη σύσταση των τελικών φορέων (λιπιδική σύσταση λιποσωμάτων και ποσοστό ενσωματωμένου υπερδιακλαδισμένου πολυμερούς ανάλογα με την ψευδογενιά αυτού), η ικανότητα εγκλωβισμού και ο ρυθμός αποδέσμευσης της DOX, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των φωσφολιπιδίων, των HBPs και της DOX που επηρεάζουν τον εγκλωβισμό και την απελευθέρωσή της αλλά και τη σταθερότητα των συστημάτων, καθώς και η επίδραση επιπλέον παραμέτρων μορφοποίησης, όπως η παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων σουκρόζης και η διαφορά ωσμωτικής πίεσης εκατέρωθεν της λιπιδικής διπλοστοιβάδας των λιποσωμάτων. Τέλος, πραγματοποιήθηκε τροποποίηση της δομής των HBPs (αλλαγή των τελικών υδροξυλομάδων σε καρβοξυλομάδες) και μελετήθηκε η επίδραση της φύσης των τελικών ομάδων των πολυμερών στην ικανότητα εγκλωβισμού της DOX.