Νανοδομημένα συστήματα μεταφοράς φαρμάκων με δυνατότητα διαπέρασης των βλεννωδών ιστών

Abstract

The purpose of this research project was to investigate the development of feasible mucus penetrating drug delivery systems in order to enhance the bioavailability of many therapeutic macromolecules. Mucus poses a dynamic semi-permeable barrier, which enables the exchange of nutrients, water, gases etc., while it simultaneously constitutes an impermeable barrier to most bacteria and pathogens. However, mucus elaborate architecture can also lead to the immobilization of macromolecules, hindering their passage and further absorption through the epithelium. Therefore, the scientific interest has focused on the development of functional nanocarriers, which has the ability to overcome this critical barrier and enhance the oral delivery of many macromolecular drugs.In the present study, mucus permeating self-nanoemulsifying drug delivery systems (SNEDDS) were developed as vehicles for the controlled oral delivery of insulin and PEP356 peptide. The design of this delivery system consisted of several combinations of oil/surfactant/cosurfactant in order to evaluate the self-nanoemulsifying performance of various excipients. An extensive experimental study was performed in order to assess the physicochemical properties of SNEDDS (i.e., average droplet size, in vitro cytotoxicity, in vitro permeability etc.) and select the most promising candidates for the incorporation of insulin or PEP356 peptide. Hydrophobic ion pairing was applied for the synthesis of protein/peptide complexes with an anionic phospholipid (DMPG) in order to improve drug solubility in SNEDDS. Drug-loaded SNEDDS were evaluated with respect to drug loading, release of the drug and drug protection against enzymatic degradation. The results demonstrated that the developed SNEDDS could be considered as novel delivery systems for the oral administration of peptides and proteins.Additionally, functional mucus permeating nanoparticles were synthesized, using poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) polymer modified with polyethylene glycol (PEG). A promising hypothesis prevails that coating particles with a high PEG density can efficiently reduce particle-mucus adhesive interactions, since the hydrophilic PEG can effectively shield the hydrophobic core of the PLGA polymer. Accordingly, various PLGA-PEG copolymers were synthesized via the carbodiimide method and were evaluated in terms of the final PEG:PLGA molar ratio. Subsequently, PLGA-PEG nanoparticles were synthesized by the double emulsion method and were evaluated in comparison with unmodified PLGA nanoparticles (i.e., average size, zeta-potential, stability, in vitro cytotoxicity, in vitro permeability etc.). PLGA-PEG nanoparticles presented improved characteristics compared to unmodified nanoparicles with respect to their mucus permeability. The results showed that these functional nanoparticles exhibited higher mucus penetration rates in comparison with blank PLGA nanoparticles, indicating the reduction of adhesive interactions with mucus due to their high PEG surface coverage.Finally, a mucolytic approach was also performed in order to further enhance the permeability of PLGA-PEG nanoparticles. Mucolytic agents tend to disrupt the barrier properties of the mucus layer, thus affecting its bulk viscoelasticity. Accordingly, the mucolytic agent, 4-mercaptobenzoic acid (4-MBA), was encapsulated into PLGA-PEG nanoparticles in order to improve their transmucosal delivery compared to blank PLGA-PEG nanoparticles. Unfortunately, the results showed a fast initial release of 4-MBA, which is considered undesirable in order to facilitate improved retention time of drug carriers and evoke the local only disruption of mucus.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διεξάγεται η πειραματική μελέτη της σύνθεσης καινοτόμων συστημάτων μεταφοράς βιομορίων, τα οποία έχουν την ικανότητα να διαπερνούν τη βλέννα. Ο βλεννογόνος είναι υπεύθυνος για την παραγωγή της βλέννας, η οποία αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού. Η βλέννα αποτελεί ένα δυναμικό, ημιπερατό στρώμα, το οποίο επιτρέπει τη μεταφορά ουσιών, όπως θρεπτικών συστατικών, νερού και αερίων, ενώ ταυτόχρονα αποτρέπει την είσοδο βακτηρίων και παθογόνων μικροοργανισμών. Ωστόσο, η βλέννα αποτρέπει την είσοδο όχι μόνο των παθογόνων παραγόντων, αλλά και των βιομορίων, αποτρέποντας τη διέλευση τους μέσω της βλέννας και την περαιτέρω απορρόφηση τους από τα επιθηλιακά κύτταρα. Για το λόγο αυτό, το επιστημονικό ενδιαφέρον έχει στραφεί στην εφαρμογή καινοτόμων τεχνικών για τη σύνθεση λειτουργικών νανοφορέων, οι οποίοι επιτρέπουν την αποτελεσματική χορήγηση βιομορίων μέσω των βλεννωδών μεμβρανών.Στην παρούσα μελέτη αναπτύχθηκαν διάφοροι τύποι νανοφορέων ικανών να διαπερνούν τη βλέννα, εφαρμόζοντας διάφορες καινοτόμες στρατηγικές. Πιο συγκεκριμένα, αναπτύχθηκαν αυτο-νανογαλακτωματοποιούμενα συστήματα μεταφοράς φαρμάκων (SNEDDS), τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως φορείς για την ελεγχόμενη στοματική χορήγηση της ινσουλίνης και του πεπτιδίου PEP356. Κατά τον πειραματικό σχεδιασμό των SNEDDS, επιλέχθηκαν διάφοροι συνδυασμοί ελαίου/επιφανειοδραστικής ουσίας/συνεπιφανειοδραστικής ουσίας και μελετήθηκε η ικανότητα αυθόρμητου σχηματισμού νανογαλακτώματος. Στη συνέχεια, ακολούθησε ο χαρακτηρισμός των SNEDDS και επιλέχτηκαν οι βέλτιστοι συνδυασμοί. Επιπροσθέτως, εφαρμόστηκε η μέθοδος της υδρόφοβης ιοντικής σύζευξης για τη σύνθεση συμπλόκων ινσουλίνης ή PEP356 με ανιονικό φωσφολιπίδιο (DMPG), με στόχο τη μείωση της υδροφιλικότητάς τους. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε η ενσωμάτωση των συμπλόκων στα SNEDDS και ακολούθησε η μελέτη του ρυθμού αποδέσμευσης καθώς και ο έλεγχος της προστασίας από τα SNEDDS έναντι της δράσης ενζύμων του εντέρου. Τα αποτελέσματα απέδειξαν τη σύνθεση ενός καινοτόμου συστήματος μεταφοράς φαρμάκων για την αποτελεσματική στοματική χορήγηση θεραπευτικών βιομορίων.Επιπροσθέτως, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση νανοσωματιδίων με «ολισθηρή» επιφάνεια, χρησιμοποιώντας το πολυμερές πολυ(γαλακτικό-γλυκολικό) οξύ (PLGA) και το πολυμερές πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG). Τα τελευταία χρόνια, έχει επικρατήσει ότι η επιφανειακή κάλυψη των σωματιδίων με PEG έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση των αλληλεπιδράσεων προσκόλλησης, οι οποίες δημιουργούνται μεταξύ των σωματιδίων και της βλέννας. Συνεπώς, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση διαφόρων τύπων συμπολυμερών μέσω της αντίδρασης του καρβοδιιμιδίου και ακολούθησε η αξιολόγησή τους. Εν συνεχεία, παρασκευάστηκαν νανοσωματίδια PLGA-PEG με τη μέθοδο του διπλού γαλακτώματος και πραγματοποιήθηκε ο πλήρης χαρακτηρισμός τους. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα νανοσωματίδια PLGA-PEG παρουσίασαν βελτιωμένα χαρακτηριστικά σε σχέση με τα νανοσωματίδια PLGA και πιο συγκεκριμένα εμφάνισαν αυξημένη ικανότητα διάχυσης μέσα στη βλέννα, υποδεικνύοντας την ικανοποιητική μείωση των αλληλεπιδράσεων λόγω της υψηλής επιφανειακής κάλυψης με PEG.Τέλος, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση νανοσωματιδίων PLGA-PEG, που φέρουν το βλεννολυτικό παράγοντα 4-μερκαπτοβενζοϊκό οξύ (4-MBA) με στόχο την περαιτέρω ενίσχυση της ικανότητάς τους να διαπερνούν τη βλέννα σε σχέση με τα νανοσωματίδια PLGA-PEG. Η στρατηγική αυτή στηρίζεται στη βασική αρχή της τοπικής και επιλεκτικής διάρρηξης της βλέννας με τη χρήση βλεννολυτικών παραγόντων. Συνεπώς, πραγματοποιήθηκε ο εγκλεισμός του 4-MBA στα νανοσωματίδια PLGA-PEG με στόχο την αποτελεσματική διάχυση τους μέσα στη βλέννα. Δυστυχώς, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο εγκλεισμός του 4-MBA στα νανοσωματίδια PLGA-PEG δεν επέτρεψε την ελεγχόμενη αποδέσμευσή του, ευννοώντας πιθανή διάρρηξη του συνολικού βλεννώδους ιστού, οδηγώντας πιθανόν σε ανεπιθύμητες για τον οργανισμό παρενέργειες.