Study of the neuroprotective and neurogenic actions of synthetic micromolecules in animal models of neurodegeneration

Abstract

The adult mammalian brain possesses only a limited capacity for regeneration underpathological conditions that cause neuronal cell loss. However, the identification ofendogenous adult neural stem cells (aNSCs) that can proliferate and differentiate intofunctional neurons, unveil new intriguing possibilities towards restoration of brainfunction in case of a disease. aNSCs that lie mainly in the area of the dentate gyrus(DG) and in the subventricular zone (SVZ) are generated continuously and after theydifferentiate they get integrated to the existing circuit. These cells are responsive tointrinsic as well as external stimuli that affect their proliferation, their survival anddifferentiation. Such molecules are neurotrophins such as Nerve growth factor (NGF)and Brain derived neurotrophic factor (BDNF), as well as other growth factors such ashormones, which are also responsible for the patterning of nervous system duringdevelopment. Increasing neurogenesis with genetic or pharmacological manipulationimproves performance on various cognitive tasks while it has been recently shownthat there are specific types of functions of the DG that require the integration of newneurons such as pattern separation.Neurogenesis has been implicated in the pathophysiology of many neurodegenerativeand neuropsychiatric diseases. Alterations in neurogenesis have been observed invarious animal models of Alzheimer’s disease (AD) and have been linked toaccumulation of aβ amyloid and the development of neuroinflammation. On the otherhand stimulating adult hippocampal neurogenesis in these models either by means ofenvironmental enrichment, physical exercise or with pharmacological ways reducesamyloid pathology and improves cognitive function. Finally, adult neurogenesis isdramatically reduced during ageing and pharmacological agents that succeed torestore this decline were also effective to alleviate age-related memory deficits.Nevertheless, the clinical use of many molecules that have been shown to possessneurogenic properties is often problematic either because of their peptidic nature andtheir inability to cross the blood brain barrier or because they accompanied by offtarget adverse effects. For this reason, modern pharmacology is seeking of smalllipophilic molecules, which can mimic the actions of endogenous growth factors andshow good availability to the CNS as well as a good safety profile.In this study I have tested the neurogenic potential of two small molecules that belongto two different classes. One of them is fingolimod that has been approved for thetreatment of multiple sclerosis based on its ability to inhibit the egress of lymphocytesfrom lymphoid nodes, thus preventing its migration to the site of inflammation. It actsthrough activation of 5 subtypes of S1P receptors that belong to GPCR superfamilybut also as an intracellular messenger itself by regulating the expression of manygenes such as BDNF and other growth factors. However, S1P is also synthesized denovo in the CNS and S1P receptors are abundantly expressed in various regions andby a plethora of cell types in the CNS and the therapeutic effects of fingolimod havebeen tested for a wide range of CNS disorders, from neurodegenerative toneuropsychiatric conditions. Intrigued by the role of S1P during development but alsoin the maintenance of an intact nervous system I sought to determine if there are anyeffects of the -already in clinical use- agonist of S1PRs, fingolimod in regulation ofadult neurogenesis, which may contribute to its beneficial actions. My results showthat fingolimod can induce the proliferation and survival of adult hippocampalprogenitors in vivo and in vitro through activation of MAPK pathway and induction ofBDNF while it affects behavior that have been associated with the functional role ofadult neurogenesis.The other molecule that it was tested for its ability to induce adult neurogenesis was asynthetic analogue of the endogenous neurosteroid Dehydroepiandrosterone (DHEA),called BNN27. DHEA is synthesized in the periphery from the adrenal glands, butalso is synthesized de novo and secreted locally in the CNS in high concentration.DHEA has been shown to promote neuronal survival in various models ofneurodegeneration both in vivo and in vitro through divergent mechanisms and recentdata from our laboratory support the idea that some of these effects are mediated byactivation of NGF receptors (namely TrkA and p75NTR). However, the therapeutic useof DHEA is compromised because it widely affects the endocrine system by its ownor after conversion to other steroid hormones with possible tumorogenic action. Inparticular breast, endometrial, or prostate cancers have been associated withdisturbances on estrogens and androgen levels. Moreover the exact actions of DHEAcannot be distinguished from its metabolites. BNN27, has been developed bymodifications of DHEA structure in order to sustain its neuroprotective properties andavoid its further metabolism to androgens and estrogen. In this way, BNN27 lacks ofthe possible tumorogenic potential of the parent molecule, DHEA. In order to testwhether BNN27 could reproduce the anti-apoptotic effects of DHEA mediated byactivation of NGF receptors’ initiated signaling, we used cultures of sympatheticneurons that are known to be dependent on NGF for their survival as well as NGF nullmice embryos that exhibit massive cell death in the DRGs during the embryonicdevelopment. BNN27 was found efficient to reduce apoptosis due to NGF deprivationin both cases. Based on the neuroprotective actions of BNN27 I further sought toinvestigate if this molecule could support neurogenesis in the adult rodenthippocampus. BNN27, was not effective in inducing either proliferation or survival ofneural stem cells in the area in WT mice nor did it reversed neurogenic deficits in oldanimals. However, long-term administration of BNN27 ameliorated the neurogenicand cholinergic deficits in an animal model of amyloidosis, the 5XFAD mice, while italso reduced the amyloid burden.One the other part of this study I investigated the effects of microconically patternedsilicon substrates on the behavior of peripheral nervous system neurons and glialcells. Directed axonal outgrowth is necessary for nerve regeneration after an injurybut also in a broad range of applications in neuroscience such as construction ofmicrofluidic devices or neuronal interfaces. Among the factors that control theorientation of a regrowing axon are cellular cues and substrate topography. Based ontheir design, different topographies that have been tried so far to manipulate cellgrowth, migration, and differentiation of various cell types could be described by thefollowing geometries: continuous and discontinuous. These geometries could befurther classified based on the directionality as anisotropic, in which cues areprovided along a single axis or isotropic topographies which are uniform in alldirections, providing cues along multiple axesExamples of continuous topographiesare photolithographically fabricated grooved silicon substrates or electrospun polymerfibers at parallel or random orientation, while discontinuous geometries includesilicon or gold pillars or posts.Recently the bioengineering lab in IESL in FORTH developed and characterizedmicropatterned silicon culture substrates fabricated with the use ultra-fast pulsed laserstructuring. Upon increasing laser fluence surface roughness is also increased andacquires anisotropic geometrical characteristics. More specifically as we pass fromflat silicon to surfaces that display a higher degree of roughness, substrates arecomprised of microcones with elliptical shape and specific orientation. Surfaceroughness and wettablity of the micropatterned Si substrates, influence fibroblastadhesion as well as differentiation capacity of PC12 cells as response to NGF. At theframework of our collaboration we aim to investigate the effects of substrate oftopography in cell outgrowth and morphology of PNS populations.We showed thatcultured Schwann cells and sympathetic neurons of SCGs migrate or grow their axonsalong the major axis of microcones in parallel alignement. Moreover when Schwanncells are present they seem to drive the growing axons as it was revealed in coculturestudies of the populations examined as well as in whole DRG explant cultures aclassic model to study neurite outgrowth and Schwann cell migration.Our study demonstrates for first time that a discontinuous topography could drive thedirectional outgrowth of neurons and glial cells of the peripheral nervous system if itcontains at least a feature of anisotropy which is the elliptical shape of themicrocones. This distinct inherent property of our microstructures combined with theconductance of the material, provides a useful system to explore and control neuronalfunctions and subsequent network characteristics.

ΠερίληψηΑν και μέχρι πρότεινως θεωρείτο ότι δεν υπάρχει ικανότητα αναγέννησης τουνευρικού ιστού στον ενήλικο νευρικό σύστημα, κατά τη διάρκεια των τελευταίωνδεκαετιών υπάρχουν δεδομένα που υποστηρίζουν την γέννηση και λειτουργικήενσωμάτωση νέων νευρώνων σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου όπως ηυποκοιλιακή ζώνη και η οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου. Μελέτες σε διάφορα ζωικάμοντέλα έχουν καταδείξει γενετικούς, περιβαλλοντικούς και φαρμακολογικούςπαράγοντες που ελέγχουν τη διαδικασία της νευρογένεσης στον ενήλικο οργανισμό.Δυσλειτουργία αυτού του συστήματος έχει εμπλακεί στην παθογένεσηνευροεκφυλιστικών ασθενειών όπως η ασθένειες του Χαντινγκτον, Αλζχέιμερ καιΠαρκινσον καθώς και νευροψυχιατρικών καταστάσεων όπως η κατάθλιψη.Επιπρόσθετα δεδομένα συνηγορούν στην ιδέα ότι φαρμακολογική επαγωγή τηςνευρογένεσης μπορεί επηρεάσει την έναρξη και εξέλιξη συγκεκριμένωνδυσλειτουργιών του εγκεφάλου όπως στη περίπτωση τράυματος στο νευρικό ιστό καιστη κατάθλιψη. Για το λόγο αυτό η σύγχρονη φαρμακολογία ψάχνει για νέεςμικρομοριακές ουσίες που μπορούν να διαπεράσουν τον αιματεγκεφαλικό φραγμόκαι είναι ασφαλείς στη κλινική χρήση, με την ικανότητα να αυξάνουν τη ενήλικηνευρογένεση προς θεραπεία νευεκφυλιστικών ασθενειών και σχετιζόμενων με τοστρες.Η φινγκολιμόδη είναι το πρώτο εκ του στόματος χορηγούμενο φάρμακο που πήρεέγκριση για τη θεραπεία της υποτροπιάζουσας διαλείπουσας μορφής της πολλαπλήςσκλήρυνσης, μια απομυελινωτική αυτοάνοσης αιτιολογίας νόσο του ΚΝΣ. Δρα μέσωενεργοποίησης 3 υπότυπων του S1P υποδοχέα που ανήκουν στην οικογένεια τωνGPCRs μιμούμενο τις δράσεις του ενδογενούς S1P (sphingosine-1-phosphate). Oμηχανισμός που εμπλέκεται στις θεραπευτικές δράσεις της φινγκολιμόδης έγκειταιστην παρατεταμένη ενεργοποίηση του S1P1 υποδοχέα στην επιφάνεια τωνενεργοποιημένων T cells και συνεπακόλουθη ενδοκυττάρωσή του, κάτι πουσυμβάλλει σε εγκλωβισμό αυτών στους λεμφαδένες. Παρολ’ αυτά, οι υποδοχείς τουS1P εντοπίζονται σε όλα τα κύτταρα του ΚΝΣ, ενώ συστηματική χορήγηση τηςφινγκολιμόδης έχει αποδειχθεί ότι επιφέρει νευροπροστατευτικές δράσεις και αύξησητης έκφρασης του νευροτροφικού παράγοντα BDNF από τα νευρικά κύτταρα. Οιενδείξεις αυτές για τις πιθανές δράσεις της φινγκολιμόδης στο ΚΝΣ μας έκαναν νααναρωτηθούμε αν θα μπορούσε να έχει κάποια επίδραση στο φαινόμενο της ενήλικηςνευρογένεσης. Πράγματι, πράγματι χορήγηση του φαρμάκου in vivo και in vitroαύξησε το ρυθμό πολλαπλασιασμού και την επιβίωση των πρόδρομων νευρικώνκυττάρων ενώ οι δράσεις αυτές σε κυτταρικό επίπεδο συσχετίστηκαν με βελτίωσητης απόδοσης ποντικών σε ένα τεστ συμπεριφοράς που φαίνεται να αναπαριστά τολειτουργικό ρόλο της ενήλικης νευρογένεσης που είναι ο διαχωρισμόςπεριβάλλοντων.Η διυδροεπιανδροστερόνη (DHEA) είναι ένα το πιο άφθονο νευροστεροειδές πουπαράγεται στη περιφέρεια απο τα επινεφρίδια και της γονάδες ενώ επίσης παράγεταιτοπικά στον εγκέφαλο. Μεταβολικά προιόντα της DHEA είναι τα οιστρογόνα και ταανδρογόνα. Τα ποσά αυτής μειώνονται δραματικά κατά τη γήρανση και έχουνσχετισθεί με την εμφάνιση νευροεκφυλιστικών ασθενειών όπως η νόσος Αλζχέιμερς.Η DHEA έχει δειχθεί πως αυξάνει τη νευρογένεση σε in vitro και in vivo μοντέλαενώ αναστέλλει την επιβλαβή δράση των γλυκοκορτικοειδών και ενισχύει τηνεπαγωγική δράση των αντικαταθλιπτικών.Τα τελευταία χρόνια στο εργαστηριό μας έχει καταδειχθεί η νευροπροστατευτικήδράση της DHEΑ μέσω της ενεργοποίησης ενδοκυττάριων μονοπατιών που έχουνσαν τελικό αποτέλεσμα την επαγωγή έκφρασης αντιαποπτωτικών πρωτεινών όπως ηBcl-2. Επίσης, η DHEA φαίνεται να μιμείται την δράση του Νευρικού αυξητικούπαράγοντα (NGF) μετά απο πρόσδεση και ενεργοποίηση των υποδοχέων τουμειώνοντας την αποπτωση που προκαλείται απο αποστέρηση απο NGF σε νευρώνεςπου εξαρτούν την επιβίωσή τους απο αυτόν όπως φάνηκε απο πειράματα σεπρωτογενείς καλλιέργιες αισθητικών νευρώνων και κατα την ανάπτυξη στηνεπιβίωση αισθητικών νευρών των γαγγλίων της ραχιαίας ρίζας στα ngf -/- ποντίκια.Παράλληλα, το εργαστήριό μας έχει αναπτύξει συνθετικά μόρια της DHEA πουδιατηρούν τις νευροπροστατευτικές δράσεις της DHEA αλλά στερούνται τηςικανότητας μεταβολισμού προς ανδρογόνα και οιστρογόνα. Τα μόρια αυτά ώςμικρομοριακά και λιπόφιλα έχουν την ικανότητα να διαπερνούν τοναιματοεγκεφαλικό φραγμό και μπορούν να χορηγηθούν περιφερικά χωρίς το κίνδυνοεμφάνισης ορμονοεξαρτώμενων δυσλειτουργιών.Στο δεύτερο μέρος της διδακτορικής μου διατριβής επικεντρώθηκα στη διερεύνησητης πιθανής δράσης των μορίων αυτών και συγκεκριμένα ενός εξ αυτών με τηνονομασία ΒΝΝ27 στη νευρογένεση στον ενήλικο ιππόκαμπο κατα τη γήρανση καιτην εμφάνιση της νόσου του Αλζχέιμερ. Το ΒΝΝ27 φάνηκε ανίκανο να αυξήσει τηνευρογένεση σε ποντικούς αγρίου τύπου ούτε να αναστείλει την μείωση τουπολλαπλασιασμού των πρόδρομων νευρικών κυττάρων κατά τη γήρανση. Παρολ’αυτά το ΒΝΝ27 ήταν ικανό να αναστείλει τη μείωση στο ρυθμό νευρογένεσης στα5XFAD ποντίκια, τα οποία φέρουν 5 μεταλλάξεις που έχουν συνδεθεί με τηνοικογενή μορφή της νόσου Αλζχέιμερ. Στα ίδια διαγονιδιακά ποντίκια το ΒΝΝ27είναι ικανό να μειώσει την ατροφία των χολινεργικών νευρώνων και τη συσσώρευσητου αμυλοειδούς επηρεάζοντας θετικά πολλά στοιχεία της παθολογίας της νόσουΑλζχέιμερ.Στο τρίτο και τελευταίο μέρος της διατριβής μου μελέτησα το τρόπο με τον οποίοεπιδρά η τοπογραφία του μικροπεριβάλλοντος των νευρικών κυττάρων καισυγκεκριμένα αυτή που δημιουργείτε από διατάξεις μικροκόνων ελλειπτικήςδιατομής από πυρίτιο, στον προσανατολισμό της νευραξονικής αναγέννησης και τηςκυτταρικής μετανάστευσης. Φαίνεται ότι το συγκεκριμένο είδος τοπογραφίας τοοποίο χαρακτηρίζεται από μη συνεχόμενη γεωμετρία παρόλ’αυτά περιέχει έναστοιχείο ανισοτροπίας που είναι η κεντρική άξονα της ελλειπτικής διατομής τωνμικροκόνων, μπορεί να κατευθύνει τη προσονατολισμό των νευραξόνων τουπεριφερικού νευρικού συστήματος καθώς και τη μετανάστευση κυττάρων Schwann,τα κύτταρα της γλοίας που περιβάλλουν τους άξονες στη περιφέρεια. Η μελέτη τηςσυγκεκριμένης τοπογραφίας μπορεί να συμβάλλει στη δημιουργία μικροροικούνκατασκευών, νευροαισθητήρων για ταυτόχρονη διέγερση και καταγραφή αποκρίσεωννευρονικών δικτύων αλλά και στην ανάπτυση θεραπευτικών λύσεων για επαγωγή καιπροσανατολισμό της νευραξονικής αναγέννησης σε περιπτωση τραύματος στονευρικό ιστό.