Ο ρόλος των microRNAs και της πρωτεΐνης RhoB στην ιική μόλυνση από τον ανθρώπινο κυτταρομεγαλοϊό

Abstract

Human Cytomegalovirus (HCMV), an ubiquitous β-herpesvirus, is a significant pathogen that causes medically severe diseases in immunocompromised individuals and in congenitally infected neonates. RhoB belongs to the family of Rho GTPases, which regulates diverse cellular processes. Rho proteins are implicated in the entry and egress from the host cell of mainly α- and γ-herpesviruses, whereas β-herpesviruses are the least studied in this regard. Here, we studied the role of RhoB GTPase during HCMV lytic infection. Microscopy analysis, both in fixed and live infected cells showed that RhoB was translocated to the assembly complex/compartment (AC) of HCMV, a cytoplasmic zone in infected cells where many viral structural proteins are known to accumulate and assembly of new virions takes place. Furthermore, RhoB was localized at the AC even when the expression of the late HCMV AC proteins was inhibited. At the very late stages of infection, cellular projections were formed containing RhoB and HCMV virions, potentially contributing to the successful viral spread. Interestingly, the knockdown of RhoB in HCMV-infected cells resulted in a significant reduction of the virus titer and could also affect the accumulation of AC viral proteins at this subcellular compartment. RhoB knockdown also affected actin fibers' structure. Actin reorganization was observed at late stages of infection originating from the viral AC and surrounding the cellular projections, implying a potential interplay between RhoB and actin during HCMV assembly and egress. Last but not least, it was found that other Rho proteins localize at the HCMV AC, which exhibits an interesting configuration among neighboring cells. In conclusion, our results demonstrate for the first time that RhoB is a constituent of the viral AC and is required for HCMV productive infection and that other Rho proteins are also implicated in the late stages of HCMV lytic infection. MicroRNAs (miRNAs) are small RNAs that based on their complementarity to mRNAs, bind to them and affect, mostly negatively, their expression. MiRNAs are expressed in a variety of organisms, such as plants, humans and many viruses, including HCMV. Both cellular and viral miRNAs can regulate cellular as well as viral transcripts, and in this way they can affect the course of the infection. In this study, the effect of HCMV on the expression of cellular miRNAs was investigated throughout the course of the lytic infection of human fibroblasts. Using miRNA microarrays, 26 differentially expressed miRNAs were identified. From the above miRNAs, 14 exhibited increase and were further divided into four groups based on the time pattern of their change, and 12 exhibited decrease and were further divided into 3 groups. Eight of the above 26 HCMV affected miRNAs, had a significant effect on the progression of the lytic infection of the virus, since the reversion of their virus induced change, resulted in the significant reduction of the virus titer. These 8 miRNAs were further studied with bioinformatics and their predicted cellular targets were identified. Among them, the most likely targets were selected and subsequently these predictions were validated with luciferase and Real-Time PCR assays. The miRNAs and their targets were associated in two networks, in which a coordinated time change of the expression of the miRNAs and the mRNAs of their targets was observed. Three miRNAs were included in the first network, the inflammatory network, and the remainder 5 miRNAs were included in the second network, the chromatin network. These two networks seem to play an important role in the outcome of the infection, since the deregulation of even individual miRNAs that participate in them, had an important negative effect on the expression of many viral genes and on the viral yield.

Ο ανθρώπινος κυτταρομεγαλοϊός (ο ιός HCMV, human cytomegalovirus), ένας πολύ διαδεδομένος ερπητοϊός, είναι ένα σημαντικό παθογόνο και προκαλεί σοβαρά νοσήματα στους ανοσοκατεσταλμένους και στα νεογνά με συγγενή νόσο. Η πρωτεΐνη RhoB ανήκει στην οικογένεια των Rho GTPασών, η οποία ρυθμίζει ποικίλες κυτταρικές διεργασίες. Οι πρωτεΐνες Rho εμπλέκονται στην είσοδο και την έξοδο από το κύτταρο, κυρίως των α- και γ- ερπητοϊών, ενώ οι β-ερπητοϊοί είναι οι λιγότερο μελετημένοι ως προς αυτό το θέμα. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο ρόλος της RhoB GTPασης κατά τη διάρκεια της λυτικής μόλυνσης του ιού HCMV. Ανάλυση μικροσκοπίας, τόσο σε μονιμοποιημένα όσο και σε ζωντανά κύτταρα κατέδειξε ότι η πρωτεΐνη RhoB μετατοπίστηκε στο κυτταροπλασματικό διαμέρισμα συναρμολόγησης του ιού HCMV (assembly complex/ assembly compartment, AC), μία κυτταροπλασματική περιοχή στα μολυσμένα κύτταρα όπου πολλές ιικές δομικές πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι αθροίζονται και πραγματοποιείται η συναρμολόγηση νέων ιοσωματίων. Επιπλέον, η πρωτεΐνη RhoB εντοπίστηκε στο AC ακόμη κι όταν η έκφραση των όψιμων ιικών πρωτεϊνών ανεστάλη. Στα πολύ όψιμα στάδια της μόλυνσης, σχηματίστηκαν κυτταρικές προσεκβολές οι οποίες περιείχαν την πρωτεΐνη RhoB και ιοσωμάτια του ιού HCMV, φαινόμενο που πιθανόν συνεισφέρει στην επιτυχή ιική διασπορά. Παρουσιάζει ενδιαφέρον ότι η καταστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης RhoB στα μολυσμένα από τον ιό HCMV κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του ιικού τίτλου και μπορούσε επίσης να επηρεάσει την άθροιση στο AC των εντοπιζόμενων στο συγκεκριμένο κυτταρικό διαμέρισμα ιικών πρωτεϊνών. Η καταστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης RhoB επηρέασε επίσης τη δομή των ινιδίων ακτίνης. Παρατηρήθηκε αναδιοργάνωση των ινιδίων ακτίνης στα όψιμα στάδια της μόλυνσης, η οποία εκπορευόταν από το ιικό AC και περιέβαλε επίσης τις κυτταρικές προσεκβολές, υποδηλώνοντας μια πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτεΐνης RhoB και της ακτίνης κατά τη διάρκεια της συναρμολόγησης και της εξόδου του ιού HCMV. Τέλος, αναγνωρίστηκαν και άλλες Rho πρωτεΐνες, οι οποίες εντοπίζονται στο AC του ιού HCMV, το οποίο παρουσιάζει μια ιδαίτερη διαμόρφωση ανάμεσα σε γειτονικά κύτταρα. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης καταδεικνύουν για πρώτη φορά ότι η πρωτεΐνη RhoB είναι ένα συστατικό του ιικού AC και είναι αναγκαία για την παραγωγική μόλυνση του ιού HCMV, καθώς επίσης και ότι και άλλες Rho πρωτεΐνες εμπλέκονται στα όψιμα στάδια της λυτικής μόλυνσης του ιού HCMV. Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά μόρια RNA τα οποία βάσει της συμπληρωματικότητάς τους με τα mRNAs, προσδένονται σε αυτά και επηρεάζουν, συνηθέστερα αρνητικά, την έκφρασή τους. Τα miRNAs εκφράζονται σε πολλούς οργανισμούς, όπως στα φυτά, στον άνθρωπο και σε πολλούς ιούς, συμπεριλαμβανομένου του ιού HCMV. Τα κυτταρικά και τα ιικά miRNAs μπορούν να ρυθμίσουν τόσο κυτταρικά όσο και ιικά γονίδια, και με τους τρόπους αυτούς να επηρεάσουν την πορεία της μόλυνσης. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η επίδραση του ιού HCMV στην έκφραση των κυτταρικών miRNAs καθ' όλη τη διάρκεια της λυτικής μόλυνσης του ιού σε ανθρώπινους ινοβλάστες. Με μικροσυστοιχίες miRNAs, αναγνωρίστηκαν 26 κυτταρικά miRNAs, των οποίων η έκφραση μεταβλήθηκε σημαντικά. Από τα miRNAs που μεταβλήθηκαν, τα 14 παρουσίασαν αύξηση και διαχωρίστηκαν περαιτέρω σε τέσσερις ομάδες βάσει του χρονικού προτύπου της μεταβολής τους, και τα 12 εκδήλωσαν μείωση της έκφρασης και διαχωρίστηκαν σε τρεις περαιτέρω ομάδες. Από τα 26 miRNAs που επηρέασε ο ιός HCMV, τα 8 είχαν πολύ σημαντική επίδραση στην εξέλιξη της λυτικής μόλυνσης του ιού, καθώς η αναστροφή της προκαλούμενης από τον ιό μεταβολής της έκφρασής τους, είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του παραγώμενου ιού. Τα συγκεκριμένα 8 κυτταρικά miRNAs μελετήθηκαν περαιτέρω και με προγράμματα βιοπληροφορικής αναγνωρίστηκαν οι πιθανοί κυτταρικοί στόχοι τους. Από αυτούς επιλέχθηκαν οι επικρατέστεροι στόχοι και στη συνέχεια αυτές οι προβλέψεις επαληθεύτηκαν με πειράματα ενεργότητας λουσιφεράσης και αναλύσεις πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-Time PCR). Τα miRNAs και οι στόχοι τους συσχετίσθηκαν σε δύο δίκτυα, στα οποία παρατηρήθηκε συντονισμένη χρονικά μεταβολή της έκφρασης των miRNAs και των mRNAs των στόχων τους. Στο πρώτο δίκτυο, το δίκτυο της φλεγμονής συμπεριελήφθησαν 3 miRNAs και στο δεύτερο δίκτυο, το δίκτυο χρωματίνης, συμπεριελήφθησαν τα υπόλοιπα 5 miRNAs. Τα δύα αυτά δίκτυα φαίνεται ότι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην έκβαση της μόλυνσης, καθώς η απορρύθμιση ακόμη και μεμεονωμένων miRNAs που μετέχουν σε αυτά, επηρέασε αρνητικά την έκφραση πολλών ιικών γονιδίων και προκάλεσε μείωση του παραγώμενου ιού.