Ανάπτυξη νέων αντιαιμοπεταλιακών παραγόντων και διερεύνηση του μηχανισμού δράσης τους

Abstract

The platelet integrin aIIbβ3 plays an important role at the final step of platelet aggregation and that renders it a very promising target in the development of antiplatelet drugs. Upon platelet activation, the integrin extends and switches in its active conformation, where exhibits high affinity for the extracellular ligand. RGD - peptides strongly inhibit the binding of fibrinogen (main ligand) to the receptor and consequently platelet aggregation. However, nowadays the use of aIIbβ3 antagonists in daily clinical have been limited. It has been reported that their ligation to aIIbβ3, has as result the maintenance of the receptor in its active conformation. In this condition, the receptor induce an outside-inside signaling. The development of new aΙΙbβ3 antagonist is necessary. We have previously shown that the 8/peptide YMESRADR corresponding to amino acids 313-320 of the aIIb subunit, acts as a potent inhibitor of platelet aggregation.The purpose of this study is to highlight the mechanism through which YMESRADR exhibits its inhibitory activity effect on platelet aggregation. The results from the in silico modelling analysis of the receptor - 8/peptide interaction, showed that the peptide is able to act as a substitute for the βribbon by forming a clasp restraining the β3 hybrid and βI domains in a closed conformation. The proposed interactions involve: D319 (8/peptide) - K384 (β3), R320 (8/peptide) - E356 (β3) και Y313 (8/peptide) και E297 (β3).The residues that were found to take place at the interaction, were confirmed by studies of CHO cells (expressing the wild type or mutated aIIbβ3 integrin) adhesion to fibrinogen under flow conditions and inhibitory studies on platelet functions of the native or Ala substituted peptides.In order to confirm the role of the Y313 and R320 amino acid residues in the interaction with the receptor and moreover to develop new potent inhibitors of platelet aggregation, 14 aIIb derived peptides were designed, synthesized, purified, identified and tested for their inhibitory effect. The results indicated that YMESRADR exerts its inhibitory effect on fibrinogen binding through its interaction with the βI and hybrid domains of β3 subunit; maintaining the receptor in its low affinity state. This study confirms the crucial role of the D319 and R320 amino acids on peptide’s inhibitory activity. On the other hand, contribution of Y313 does not seem to be crucial. The inhibitory activity of RMESRADR peptide reinforces this point of view, wherein besides of arginine hydrogen-bonding capability, ionic interactions are possible to be developed.In conclusion, this study revealed that a new antiplatelet approach can be used for developing allosteric aIIbβ3 antagonists. These antagonists could act via their interaction with the receptor maintaining it in its low affinity state.

Ο κεντρικός ρόλος που κατέχει η αιμοπεταλιακή ιντεγκρίνη αIIbβ3 στο τελικό στάδιο συσσώρευσης των αιμοπεταλίων καθιστά τη στόχευση της μια πολύ καλή στρατηγική για την ανάπτυξη αντιαιμοπεταλιακών φαρμάκων.Κατά την αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση, η ιντεγκρίνη αIIbβ3 υφίσταται διαμορφωτικές αλλαγές και μεταβαίνει στην ενεργή της διαμόρφωση, όπου παρουσιάζει υψηλή συγγένεια για το εξωκυττάριο πρόσδεμα. Αναστολείς που περιέχουν την RGD αλληλουχία αναστέλλουν ισχυρά την πρόσδεση του ινωδογόνου (κύριος προσδέτης) στον υποδοχέα και συνεπώς τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Τα τελευταία χρόνια όμως, η χρήση αυτών των ανταγωνιστών έχει περιοριστεί σημαντικά διότι προσδένονται σε περιοχές του υποδοχέα αIΙbβ3 διαμέσου των οποίων επιφέρουν τη διαμορφωτική αλλαγή του τελευταίου, με αποτέλεσμα να ενεργοποιείται η «έξω-μέσα» σηματοδότηση. Η ανάπτυξη νέων ανταγωνιστών της ιντεγκρίνης αIΙbβ3 κρίνεται αναγκαία. Από προηγούμενες μελέτες έχει βρεθεί ότι το 8/πεπτίδιο YMESRADR που προέρχεται από την αλληλουχία 313-320 της αIIb υπομονάδας του υποδοχέα αIIbβ3, αποτελεί ισχυρό αναστολέα της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων. Σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν η διερεύνηση του τρόπου δράσης του 8/πεπτιδίου YMESRADR. Σχεδιάστηκαν πειράματα υπολογιστικών μεθόδων προσομοίωσης της αλληλεπίδρασης του 8/πεπτιδίου με τον υποδοχέα στην κεκαμμένη διαμόρφωση του. Τα αποτελέσματα από τα πειράματα αυτά, έδειξαν ότι το YMESRADR αλληλεπιδρά με τις βΙ και υβριδική περιοχή της β3 υπομονάδας κλειδώνοντας τον υποδοχέα στην ανενεργή κατάσταση του. Οι αλληλεπιδράσεις που εμπλέκονται είναι οι εξής: D319 (8/πεπτίδιο) - K384 (β3), R320 (8/πεπτίδιο) - E356 (β3) και Y313 (8/πεπτίδιο) και E297 (β3). Τα αμινοξέα που βρέθηκαν ότι λαμβάνουν μέρος στην αλληλεπίδραση, επιβεβαιώθηκαν με πειράματα προσκόλλησης υπό ροή χρησιμοποιώντας κλώνους CHO κυττάρων που εκφράζουν την ιντεγκρίνη αIIbβ3 άγριου τύπου καθώς και με μεταλλάξεις στις δυο υπομονάδες αλλά και με πειράματα ελέγχου της ανασταλτικής δράσης τόσο του μητρικού αναλόγου όσο και τροποποιημένων YMESRADR 8/πεπτιδίων (alaning scanning). Στη συνέχεια, για την επιβεβαίωση του ρόλου και την εμπλοκή των αμινοξικών καταλοίπων Y313 και R320 στην αλληλεπίδραση τους με τις δύο υπομονάδες του υποδοχέα αIIbβ3 αλλά και για την ανάπτυξη νέων ισχυρότερων αναστολέων της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων, σχεδιάστηκαν, συντέθηκαν, καθαρίστηκαν, ταυτοποιήθηκαν και εξετάστηκε η ανασταλτική δράση 14 τροποποιημένων 8/πεπτιδίων. Επίσης σχεδιάστηκαν επιπλέον 2 τροποποιημένα πεπτιδικά ανάλογα στη θέση 315. Από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής μπορούμε να συμπεράνουμε ότι το πεπτίδιο YMESRADR φαίνεται να αναστέλλει την πρόσδεση του ινωδογόνου μέσω πρόσδεσης του στην υβριδική και βI περιοχή της β3 υπομονάδας, η οποία επιβάλει τη διατήρηση του υποδοχέα σε μια ανενεργή κατάσταση. Η μελέτη αυτή επιβεβαιώνει τον καθοριστικό ρόλο των αμινοξέων D319 και R320, στην έκφραση της ανασταλτικής δράσης, ενώ δεν φαίνεται καθοριστική η συμβολή της Y313 στην αλληλεπίδραση της με τη βI περιοχή της β3 υπομονάδας. Σε ενίσχυση της παραπάνω εκτίμησης, συμβάλουν τα αποτελέσματα για το πεπτιδικό ανάλογο RMESRADR, όπου πέρα της δυνατότητας σταθεροποίησης της αλληλεπίδρασης με περισσότερους δεσμούς υδρογόνου, είναι εφικτό να αναπτύσσεται και μια ιοντικού τύπου αλληλεπίδραση. Συμπερασματικά η εργασία αυτή προτείνει μια νέα εναλλακτική αντιαιμοπεταλιακή προσέγγιση μέσω της ανάπτυξης αλλοστερικών ανταγωνιστών του αIIbβ3. Οι ανταγωνιστές αυτοί θα μπορούσαν να δράσουν μέσω αλληλεπίδρασης τους με τον υποδοχέα αIIbβ3, διατηρώντας τον στη χαμηλής συγγένειας κατάσταση.