Ανάπτυξη νέας γενιάς αντι-αιμοπεταλιακών παραγόντων με συνδυαστική παρέμβαση σε διαφορετικά μονοπάτια ενεργοποίησης και συσσώρευσης των ανθρώπινων αιμοπεταλίων

Abstract

The high sensitivity of platelets to various pathophysiological conditions made them one of the most accessible biomarkers. Through the action of their receptors, they are activated, acting as adhesion molecules that interact with the damaged endothelium, or with other platelets and leukocytes. Therefore, platelet activation and eventually clot formation has been associated with the action of specific receptors on their cell membrane.Our research focused on transmembrane platelet receptors and specifically the transmembrane multidrug resistance protein-4 (MRP4). In general, the MRP4 protein in the cell which expressed, acts as a broad-spectrum efflux pump of substrates, including nucleoside analogs, antiviral and antiplatelet drugs such as aspirin. The extrusion process requires energy, which is obtained by the hydrolysis of ATP. Hydrolysis takes place in the two intracellular domains of the protein, by binding ATP to specific amino acid sequences of each subunit. The sequences involved in the binding and hydrolysis of ATP are reported in references as Walker A, C-motif, and Walker B.Especially, the MRP4 protein in platelets is expressed both in their cell membrane and in the membrane of intraplatelet organelles, the δ-granules. The protein is involved in platelet activation and accumulation by participating in the metabolic pathway of cAMP, in two ways. Either it stores cAMP in the δ-granules (MRP4 dense granules) or it is extruding from the cell (membraned MRP4). The efflux of cAMP, which acts as a signal for neighboring platelets to be activated, in conjunction with the reduction of cAMP intraplatelet, due to its storage in the d-granules, contributes to the activation of platelets. In conclusion, the action of MRP4 in platelets is cAMP-dependent and therefore the inhibition of MRP4 will inhibit platelet activation and accumulation.The purpose of this study is to inhibit the activation and accumulation of human platelets through the development of appropriate new generation peptide anti-platelet agents based on the parent sequence of the intracellular domain of MRP4. To succeed this purpose, MRP4 peptides analogs were carefully selected and synthesized, bearing in their sequence the protein-functional Walker A, C-motif, and Walker-B motifs. Also, peptide analogs were selected to synthesize, based on sequences of intracellular MRP4 subunits, in which the interaction of specific amino acid residues aid in modulatory protein modification for substrate efflux. Finally, the peptide analogs were ligated, via thioether bond, with peptide carriers Τat(48-60)-Cys and Ac-CPSOC, which penetrate the cell membrane, for intracellular targeting of platelet activation and accumulation.After synthesis and purification of the complexes, between carriers and peptide analogs of MRP4, platelet function testing was performed for identification of inhibitory effect on platelet activation and accumulation in washed human platelets and platelet-rich plasma. To simulate the cAMP metabolic pathway in platelets, experiments were performed with or without the presence of prostaglandin PGE1. The concentration of PGE1 used was such as to cause a maximum of 10-11% of total inhibitory activity. Finally, possible combined intervention in other pathways of platelet activation and accumulation was investigated, through flow cytometry experiments.Initially, studies of cell-penetrating carriers have shown that the peptide carrier Tat(48-60)-Cys(Acm) inhibits platelet aggregation in both washed platelets and platelet-rich plasma and association with the use of PGE1 prostaglandin. In combination with the results of flow cytometry and inhibition of fibrinogen binding, it demonstrates activity against platelet function, which may be characterized by a possible non-specific extracellular activity in addition to its known intracellular activity. Ac-CPSOC, on the other hand, did not affect platelet activation, in washed platelets, or platelet-rich plasma, with or without the use of prostaglandin. This result, combined with the lack of action in flow cytometry experiments, show that the Ac-CPSOC carrier has no activity in platelet function, either extracellularly and possibly intracellularly. We conclude, therefore, that the occurrence of Ac-CPSOC activity is related to the activity of the biological cargo with which is conjugated. This can be the basis for the design of intracellular inhibitors. Thus, the Ac-CPSOC carrier is an important tool for shifting bio-cargoes intracell, especially to sensitive cells such as platelets, without parallel from carrier interactions in cell function. Subsequently, biological study (aggregation tests and flow cytometry) of the MRP4 peptide analogs conjugated with the carriers, since the Ac-CPSOC does not inhibit platelet activation, showed that two MRP4 peptide analogs have an inhibitory effect on platelet function. Their interaction with the active carrier Tat(48-60)Cys(Acm), confirmed the initial hypothesis, and also an enhancement of its inhibitory effect was observed by studying the synergists in the presence of prostaglandin PGE1. This led to the conclusion that the active peptide analogs that emerged from their interaction with the Ac-CPSOC carrier probably acted synergistically with the Tat(48-60)-Cys(Acm) carrier and synergistically with prostaglandin in the platelet operation.In conclusion, this study revealed for the first time, a new antiplatelet approach through the development of a new generation of peptide natured antiplatelet agents, derived from the MRP4 protein, with intracellular targeting. These new inhibitors could potentially act as non-specific inhibitors in different pathways of platelet activation and accumulation, inhibiting their intracellular activation synergistically with the prostaglandin PGE1, but also the binding of fibrinogen in the active state of αIIbβ3 integrin receptor.

Η υψηλή ευαισθησία των αιμοπεταλίων σε διάφορες παθοφυσιολογικές καταστάσεις, τα ανέδειξε ως έναν από τους πιο προσιτούς βιολογικούς δείκτες. Μέσω της δράσης των υποδοχέων τους ενεργοποιούνται, δρώντας ως μόρια προσκόλλησης που αλληλεπιδρούν με το κατεστραμμένο ενδοθήλιο, ή με άλλα αιμοπετάλια και λευκοκύτταρα.Η ερευνά μας επικεντρώθηκε στους διαμεμβρανικούς υποδοχείς των αιμοπεταλίων και πιο συγκεκριμένα στην διαμεμβρανική πρωτεΐνη πολυφαρμακευτικής αντίστασης MRP4 (Multidrug resistance protein 4). Γενικά η πρωτεΐνη MRP4, στα κύτταρα που εκφράζεται, δρα σαν αντλία εκροής ευρέος φάσματος υποστρώματος, συμπεριλαμβανομένων νουκλεοσιδικών αναλόγων, αντιικών και αντιαιμοπεταλιακών φαρμάκων όπως η ασπιρίνη. Για την πραγματοποίηση της διαδικασίας εξώθησης απαιτείται ενέργεια, την οποία λαμβάνει μέσω υδρόλυσης του ATP. Η υδρόλυση διαδραματίζεται στις δύο ενδοκυττάριες υπομονάδες της πρωτεΐνης, μέσω πρόσδεσης του ATP σε συγκεκριμένες αλληλουχίες των αμινοξέων κάθε υπομονάδας. Οι αλληλουχίες που συμμετέχουν στην πρόσδεση και υδρόλυση του ATP, αναφέρονται στην βιβλιογραφία ως Walker A, C-motif και Walker B.Συγκεκριμένα στα αιμοπετάλια, η πρωτεΐνη MRP4, εκφράζεται τόσο στην κυτταρική τους μεμβράνη όσο και στην μεμβράνη ενδοαιμοπεταλιακών οργανιδίων, τα δ-κοκκία. Η πρωτεΐνη εμπλέκεται στην αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση και συσσώρευση λαμβάνοντας μέρος στο μεταβολικό μονοπάτι του cAMP δρώντας με δύο τρόπους. Είτε αποθηκεύει το cAMP εντός των δ-κοκκίων (MRP4 πυκνών κοκκίων), είτε το εξωθεί από το κύτταρο (κυτταροπλασματική MRP4). Η εξώθηση του cAMP, που λειτουργεί ως σηματοδότηση για γειτονικά αιμοπετάλια, συνεργατικά με την μείωση του cAMP λόγο διαμερισματοποίησης του, μέσω της δράσης της MRP4, συμβάλλουν στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Ουσιαστικά, η δράση της MRP4 στα αιμοπετάλια είναι cAMP-εξαρτώμενη.Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν, η ανάπτυξη και ανάδειξη νέων αντιαιμοπεταλιακών παραγόντων πεπτιδικής φύσεως, προερχόμενοι από την πρωτεΐνη πολυφαρμακευτικής αντίστασης MRP4 δρώντας ως ενδοκυττάριοι αναστολείς της ενεργοποίησης και συσσώρευσης των αιμοπεταλίων. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού, επιλέχθηκαν προσεχτικά και συντέθηκαν πεπτιδικά ανάλογα της MRP4 που φέρουν στην αλληλουχία τους, τα λειτουργικά για τη δράση της πρωτεΐνης μοτίβα Walker A, C-motif και Walker-B. Επιπρόσθετα, επιλέχθηκαν να συντεθούν πεπτιδικά ανάλογα, αλληλουχιών των ενδοκυττάριων υπομονάδων της MRP4, που βοηθούν στις διαμορφωτικές αλλαγές της πρωτεΐνης για την εκροή υποστρωμάτων. Τέλος, τα πεπτιδικά ανάλογα συμπλέχθηκαν, μέσω θειοαιθερικό δεσμό, με πεπτιδικούς φορείς Τat(48-60) και Ac-CPSOC, που διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη των κυττάρων, με σκοπό την μελέτη ενδοκυττάρια στόχευση στην αναστολή της αιμοπεταλιακής ενεργοποίησης.Με την ολοκλήρωση της σύνθεσης και καθαρισμού των συμπλεγμάτων, των φορέων με τα πεπτιδικά ανάλογα της MRP4, πραγματοποιήθηκαν μελέτες ανασταλτικής δράσης στην αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση και συσσώρευση τόσο σε πλυμένα ανθρώπινα αιμοπετάλια όσο και σε πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια. Για να προσομοιωθούν οι συνθήκες του μεταβολικού μονοπατιού του cAMP, οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν και με την παρουσία προσταγλανδίνης PGE1. Η συγκέντρωση της PGE1 που χρησιμοποιήθηκε ήταν τέτοια ώστε να προκαλεί το πολύ 10-11% συνολική ανασταλτική δράση. Τέλος, διερευνήθηκε και πιθανή συνδυαστική παρέμβαση σε άλλα μονοπάτια της αιμοπεταλιακής ενεργοποίησης και συσσώρευσης, μέσω πειραμάτων κυτταρομετρίας ροής.Αρχικά, από τις μελέτες των πεπτιδικών φορέων, αποδείχτηκε ότι ο πεπτιδικός φορέας Τat(48-60)-Cys(Acm), αναστέλλει την αιμοπεταλιακή συσσώρευση τόσο σε πλυμένα αιμοπετάλια όσο και σε πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια και συνεργατικά με τη χρήση της προσταγλανδίνης PGE1. Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα της κυτταρομετρίας ροής και την αναστολή πρόσδεσης του ινωδογόνου, αποδεικνύεται μια δραστικότητα έναντι της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων, η οποία μπορεί να χαρακτηριστεί από μια πιθανή μη ειδική εξωκυττάρια δράση εκτός της γνωστής ενδοκυττάριας δράση του. Απεναντίας, ο φορέας Ac-CPSOC, δεν επηρέασε την αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση, ούτε σε πλυμένα αιμοπετάλια ούτε σε πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια, είτε με τη χρήση της προσταγλανδίνης είτε χωρίς. Το αποτέλεσμα αυτό σε συνδυασμό με την μη εμφάνιση δράσης και στα πειράματα κυτταρομετρίας, δείχνουν ότι ο φορέας Ac-CPSOC, δεν εμφανίζει καμία δραστικότητα στην αιμοπεταλιακή λειτουργία ούτε εξωκυττάρια και πιθανώς ούτε ενδοκυττάρια. Συμπεραίνουμε λοιπόν, ότι η εμφάνιση δραστικότητας του φορέα είναι συνδεδεμένη με την δραστικότητα του βιολογικού φορτίου με το οποίο συμπλέκεται. Αυτό μπορεί να αποτελέσει βάση για σχεδιασμό ενδοκυττάριων αναστολέων. Συνεπώς, ο φορέας Ac-CPSOC αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο για την μετατόπιση βιολογικών-φορτίων ενδοκυττάρια, ειδικά σε ευαίσθητα κύτταρα όπως τα αιμοπετάλια, χωρίς παράλληλες αλληλεπιδράσεις του φορέα στην λειτουργικότητα των κυττάρων.Στη συνέχεια, από την βιολογική μελέτη (συσσωρευομετρία και κυτταρομετρία ροής) των συμπλεγμάτων των πεπτιδικών αναλόγων της MRP4 με τους φορείς, δεδομένου ότι ο φορέας Ac-CPSOC δεν επιφέρει οποιαδήποτε αναστολή στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, αποδείχθηκε ότι δύο πεπτιδικά ανάλογα της MRP4 εμφανίζουν πιθανή ενδοκυττάρια ανασταλτική δράση στην αιμοπεταλιακή λειτουργεία. Η σύμπλεξη τους με τον δραστικό φορέα Τat(48-60)-Cys(Acm), επιβεβαίωσε την αρχική υπόθεση και επιπρόσθετα παρατηρήθηκε ενίσχυση της ανασταλτικής του δράσης μελετώντας τα συνεργατικά και με την παρουσία προσταγλανδίνης PGE1. Το γεγονός αυτό οδήγησε στο συμπέρασμα, ότι τα δραστικά πεπτιδικά ανάλογα που αναδείχτηκαν από την σύμπλεξη τους με τον φορέα Ac-CPSOC, πιθανών δρουν συνεργατικά με τον φορέα Τat(48-60)-Cys(Acm) και συνεργιστικά με την προσταγλανδίνη έναντι της αιμοπεταλιακής λειτουργίας. Συμπερασματικά, η εργασία αυτή προτείνει για πρώτη φορά, μια νέα αντιαιμοπεταλιακή προσέγγιση μέσω της ανάπτυξης νέας γενιάς αντιαιμοπεταλιακών παραγόντων πεπτιδικής φύσεως, προερχόμενων από την πρωτεΐνη MRP4, με ενδοκυττάρια στόχευση. Οι νέοι αυτοί αναστολείς, θα μπορούσαν πιθανών να δράσουν σαν μη ειδικοί αναστολείς σε διαφορετικά μονοπάτια της αιμοπεταλιακής ενεργοποίησης και συσσώρευσης, αναστέλλοντας ενδοκυττάρια την ενεργοποίηση τους συνεργιστικά με την προσταγλανδίνη PGE1, αλλά και την πρόσδεση του υποδοχέα αIIbβ3 στο ινωδογόνο.