Σχεδιασμός, σύνθεση και μελέτη δομικών και διαμορφωτικών χαρακτηριστικών πεπτιδίων με βιολογική δράση στην έκκριση και τις κυτταρικές συνδέσεις ενδοθηλιακών κυττάρων

Abstract

The aim of this study was to develop a new cell penetrating peptide carrier able to transport multiple copies of a bioactive compound into cells. A new Cell Penetrating Sequential Carrier (CPSC), formed by the repetitive -Lys-Aib-Cys- moiety, which incorporates the cysteine residue for anchoring bioactive molecules through a thioether bond was designed and tested for its ability to penetrate the cell membrane. To test the ability of the CPSC to penetrate the cell membrane we synthesized the carboxyfluorescein-labelled CPSC, CF-Ahx-[Lys-Aib-Cys(-CH₂CONH₂)]₄-NH₂. As positive control was used the CF-Tat-Cys(-CH₂CONH₂)-NH₂ since it has been shown to deliver a large variety of cargoes into the cells. It was demonstrated that CF-Ahx-[Lys-Aib-Cys(-CH₂CONH₂)]₄-NH₂ penetrate the cell membrane and can be used as a cargo transporting molecule. Also, conformational studies were carried out by circular dichroism spectroscopy (CD), in order to define the structure of CPSC both in aqueous and miceller environment. Another target of this work was to investigate the ability of CPSC to transport cargoes with a large spectrum of molecular masses and also to define the minimal conserved region of Cdc42 (one of the member of Rho proteins) that could induce the rearrangement of actin cytoskeleton through the binding with its effect or protein, the Wiskott-Aldnch Syndrome Protein (WASP) and the possible involvement of the binding in the secretion of Wiebel-Palade bodies. Furthermore, several studies correlate Rho GTPases with the secretion of Weibel-Palade bodies, which are storage organelles (von Willebrand factor) in endothelial cells, via reorganization of the actin cytoskeleton. Aiming to this, we selected three peptides derived from the binding domain of Cdc42 [Ser¹⁵⁸-Ala-Leu-Thr-Gln-Lys-Gln-Leu-Lys-Asn-Val-Phe-Asp-Glu-Ala¹⁷²) (Cdc42(158-172), (Ile¹⁷³-Val-Ala-Leu-Glu-Pro-Pro-Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Lys-Lys¹⁸⁷) Cdc42(173-187) and (Val¹⁸¹-Ile-Lys-Lys-Ser-Lys-Lys¹⁸⁷) Cdc42(181-187) to WASP. The three peptides were synthesized in their free state and conjugated to the CPSC leading to protein-like molecules of branched architecture. The internalisation of the conjugates assessed by direct labelling with carboxyfluorescein and the effect on actin cytoskeleton detected through immunofluorescence (actin & VE-cadherin stainings) Finally, we investigated the binding of the Cdc42 selected peptides with WASP by the use of affinity column. The obtained results are summarized as follows: 1. The CD spectra showed that SPSC exhibits random conformation in aqueous solution and helical characteristics in amphiphilic environments (at TFE mixtures and SDS solutions). 2. The confocal microscopy experiments showed that CPSC is able to penetrate the cell membrane itself and also to transport four copies of covalently bound molecules. 3. The Cdc42(181-187) sequence was defined as the minimal conserved region of Cdc42 that induces the rearrangement of actin cytoskeleton. It was shown that the same sequence induces the secretion of vWF from Wiebel-Palade bodies. 4. Specific vWF-ELISA indicated that Cdc42(181-187) seems to be the minimal conserved region of Cdc42 that inhibits the secretion of vWF from Wiebel-Palade bodies.

Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η συμβολή στην ανάπτυξη ενός συνθετικού φορέα ενδοκυττάριας μεταφοράς ουσιών σε πολλαπλά αντίγραφα Ο σχεδιασμός του φορέα Ac-(Lys-AibCys)₄-NH₂ στηρίχτηκε σε προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου και συγκεκριμένα στην πληροφορία ότι η αλληλουχία -Lys(Ac)-Aib-Gly- λειτουργεί ως εκμαγείο επαγωγής 3₁₀ έλικας Η αντικατάσταση της Gly με Cys επιτρέπει την ομοιοπολική πρόσδεση μέσω θειοαιθερικού ή δισουλφιδικού δεσμού ενός ευρύτατου φάσματος ουσιών για ενδοκυττάρια στόχευση. Για τον έλεγχο της ικανότητας του φορέα Ac-(Lys-Aib-Cys)₄-NH₂ να μεταφέρει ενδοκυττάρια ουσίες μεγάλου φάσματος μοριακών βαρών επιλέχτηκαν αλληλουχίες της πρωτεΐνης Cdc42 [S¹⁵⁸-A-L-T-Q-K-G-L-K-N-V-F-D-E-A¹⁷²-NH₂Cdc42(158-172), V¹⁸¹-I-K-K-S-K-K¹⁸⁷-NH₂ Cdc42(181-187), l¹⁷³-V-A-A-L-E-P-P-V¹⁸¹-l-K-K-S-KK¹⁸⁷-NH₂ Cdc42(173-187)] οι οποίες προσδέθηκαν στον φορέα με θειαιθερικό δεσμό Η επιλογή αυτή στόχευε παράλληλα στην απόκτηση πληροφοριών και την ελαχιστοποίηση του μήκους της αλληλουχίας της Cdc42 που διατηρεί την ικανότητα αλληλεπίδρασης με την πρωτεΐνη WASP Η παραπάνω αλληλεπίδραση είναι γνωστό ότι συμμετέχει στην διαδικασία αναδιάταξης του κυτταροσκελετού, καθώς και στην επαγωγή της έκκρισης του παράγοντα von Willebrand. Οι βιοχημικές αυτές διεργασίες μπορούν να προσφέρουν ταυτόχρονα πληροφορίες για την εισαγωγή των συμπλεγμάτων στον ενδοκυττάριο χώρο: - Από τις διαμορφωτικές μελέτες με κυκλικό διχρωισμό σε υδατικό και αμφίφιλο περιβάλλον του προτύπου μορίου-φορέα Ac-[Lys-Aib-Cys(CH₂CONH₂)]₄-NH₂ προέκυψε ότι σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες και μικρότερες της κρίσιμης συγκέντρωσης σχηματισμού μικυλλίων, ο φορέας αρχίζει να προσλαμβάνει χαρακτηριστικά ελικοειδούς διαμόρφωσης. Το ποσοστό της έλικας αυξάνει καθώς αυξάνεται η περιεκτικότητα σε TFE ή η συγκέντρωση SDS. Ο φορέας CPSC διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη το ίδιο καλά με τον φορέα Tat, που αποτέλεσε το θετικό φορέα αναφοράς, και μεταφέρει επιτυχώς τις αλληλουχίες της πρωτεΐνης Cdc42 που έχουν προσδεθεί σε αυτό. - Η αλληλουχία Cdc42(181-187) φαίνεται να είναι η μικρότερη αλληλουχία που διατηρεί την ικανότητα αλληλεπίδρασης με τη WASP, επάγοντας αναδιάταξη του κυτταροσκελετού της ακτίνης. - Η αλληλουχία Cdc42(181-187) αναστέλλει την έκκριση του vWF από τα Wiebel-Palade Bodies.