Βιο-λειτουργικότητα επιφανειών για μελέτες ενός μορίου

Abstract

For the purposes of this dissertation, particular surfaces were treated in order to attach cellular organelles (ribosome), proteins (BMP2) or a chemical purine analogue, reversine, using a method based on the interaction of biotin-streptavidin in order to perform single molecule experiments and differentiation experiments that lead to the transformation of mesenchymal stem cells to osteoblasts, respectively. It was found that 241 ribosomes produced 100 molecules of GFPem, a rate of almost 41%, in the case of ribosomes that were attached to the surfaces through the wtL4 and were used as reference. On the contrary, ribosomes that incorporated the mutEcL22loop1, produced the same protein in a greater percentage, almost 56%, since 185 of the attached ribosomes produced 104 molecules of GFPem, while 1033 attached ribosomes that incorporated the mutEcL4E51A, produced 59 GFPem, a percentage of almost 6% which is greatly reduced compared to wild-type ribosomes. In both cases, the results are in total agreement with the previous results that were found by using reconstituted ribosomes that had incorporated the same proteins (Dr. A. Tsagkalia and collaborators, upcoming results, in composition). In conclusion, the “nano-device” that was developed, proved and confirmed the previous results that concerned the functionality of certain areas of the components of translation and is suggested for single molecule studies. In vivo biotinylated proteins (BMP2) or the chemical purine analogue (reversine) that was synthesized and biotinylated in vitro, were attached to the surfaces of the materials PET/SiO2 or PMMA-HEMA 5%. The induced differentiation of mesenchymal stem cells was studied, since it was found previously that the aforementioned materials were not toxic (MTT test). The ability of the in vivo biotinylated BMP2 that is attached to the surfaces, to differentiate mesenchymal stem cells to osteoblasts, allows the development and manufacture of implants that can be used for the reconstruction of bone tissue that was previously injured. Moreover, it was found that the dedifferentiation ability of reversine is not limited in cells of a certain germ line and can be used for the reconstruction of tissues by using any somatic cell type since it can reprogram lung cells MRC5 to a more pluripotent state, which later can be differentiated to osteoblasts under lineage-specific inducing conditions.

Στα πλαίσια της προκείμενης εργασίας, συγκεκριμένες επιφάνειες υπέστησαν κατεργασία προκειμένου να καθηλωθούν τόσο κυτταρικά οργανίδια (ριβόσωμα) όσο και πρωτεΐνες (BMP2) ή ένα χημικό ανάλογο πουρινών, η ρεβερσίνη, με την μεθοδολογία αλληλεπίδρασης βιοτίνης-στρεπταβιδίνης για να γίνουν στη συνέχεια μελέτες ενός μορίου (single molecule experiments) και πειράματα διαφοροποίησης αρχέγονων μεσεγχυματικών κυττάρων προς οστεοκύτταρα, αντίστοιχα. Για τα ριβοσώματα που είχαν καθηλωθεί με την wtL4 και τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως ριβοσώματα αναφοράς με κατάλληλο λογισμικό βρέθηκε ότι 241 ριβοσώματα συνέθεταν 100 GFPem, ή ένα ποσοστό περίπου 41%. Αντίθετα, ριβοσώματα με ενσωματωμένη την mutEcL22loop1 συνέθεταν την ίδια πρωτεΐνη σε μεγαλύτερο ποσοστό, περίπου 56%, αφού από 185 καθηλωμένα ριβοσώματα συντέθηκαν μόλις 104 μόρια GFPem, ενώ στην περίπτωση των ριβοσωμάτων με ενσωματωμένη την mutEcL4E51A, 1033 καθηλωμένα ριβοσώματα συνέθεταν 59 GFPem, δηλαδή σε ποσοστό περίπου 6% το οποίο είναι σημαντικά μειωμένο σε σχέση με τα ριβοσώματα αγρίου τύπου. Και στις δύο περιπτώσεις τα αποτελέσματα αυτά έρχονται σε απόλυτη συμφωνία με προηγούμενα αποτελέσματα που λήφθηκαν με ανασυγκροτημένα ριβοσώματα που είχαν ενσωματώσει τις ίδιες πρωτεΐνες (Δρ.Α. Τσαγκάλια και συνεργάτες, αδημοσίευτα αποτελέσματα, υπό συγγραφή). Συμπερασματικά το «νανο-σύστημα» που αναπτύχθηκε, επαλήθευσε και επιβεβαίωσε προηγούμενα ευρήματα σχετικά με την λειτουργία συγκεκριμένων περιοχών των συστατικών της πρωτεϊνοσύνθεσης και ενδείκνυται για μελέτες σε επίπεδο ενός μορίου. Στις επιφάνειες των υλικών PET/SiO2 ή PMMA-HEMA 5% καθηλώθηκαν λειτουργικά in vivo βιοτινιλιωμένοι πρωτεϊνικοί παράγοντες (BMP2) ή το χημικό ανάλογο πουρινών (ρεβερσίνη) που συντέθηκε χημικά και βιοτινιλιώθηκε in vitro. Aφού προηγουμένως διασφαλίστηκε ο μη τοξικός χαρακτήρας των υλικών που προαναφέρθηκαν, με την δοκιμασία ΜΤΤ, μελετήθηκε η επαγώμενη διαφοροποίηση αρχέγονων μεσεγχυματικών κυττάρων. Η ικανότητα της in vivo βιοτινιλιωμένης BMP2 στις επιφάνειες PMMA-HEMA 5% να διαφοροποιεί τα μεσεγχυματικά αρχέγονα κύτταρα σε οστεοκύτταρα, ανοίγει νέα μονοπάτια για τον σχεδιασμό και την κατασκευή μοσχευμάτων για αναδόμηση οστικού ιστού που έχει υποστεί βλάβη ή τραυματισμό. Επιπρόσθετα, βρέθηκε ότι η αποδιαφοροποιητική ικανότητα της ρεβερσίνης δεν περιορίζεται σε κύτταρα μίας γενεαλογίας και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ανάπλαση ιστών χρησιμοποιώντας οποιονδήποτε σωματικό τύπο κυττάρου αφού επαναπρογραμματίζει πνευμονικά κύτταρα MRC5 σε μια πολυδύναμη κατάσταση, τα οποία στη συνέχεια διαφοροποιούνται σε οστεοβλάστες.