Μελέτη της πρόκλησης κυτταρογενετικών βλαβών από τις μυκοτοξίνες και η επίδρασή τους στη δράση αντινεοπλασματικών παραγόντων

Abstract

National and International Food Safety Organizations indicate the negative impact on Public Health due to chronic exposure on certain mycotoxins and especially on certain mycotoxin mixtures. Mycotoxins constitute secondary metabolic products of fungal species that under favorable environmental conditions are found on various food and feed. Recent risk assessment studies dealing with food chain toxins found that mycotoxins mainly produced from Aspergillus and Penicillium spp are being toxic, induce cell genome damage and are implicated in carcinogenic mechanisms even at very small concentrations at the range of nanoMolar to picoMolar.Aim of the present thesis was to evaluate possible cytotoxic, apoptotic and genotoxic actions of Sterigmatocystin (STER), Ochratoxin A (ΟΤΑ) and Citrinin (CTN) alone or in combination at concentrations from pM to μΜ on the human hepatocellular cancer cell line Hep3B. We also, assessed how mycotoxins affect the anti-neoplasmatic action of Sorafenib, a first line chemotherapeutic for advanced liver cancer. MTT reduction, relative caspase-3, mitotic index (ΜI), proliferation rate index (PRI) and Sister Chromatid Exchanges SCEs were used as endpoints of metabolic activity, apoptosis, cytotoxicity, cytostaticity and genotoxicity respectively. All mycotoxin treatments alone and in combination significantly increased SCE rates at concentrations ≥ 10-12 Μ and reduced PRI at concentrations ≥ 10-10 Μ. On the contrary the cytotoxic and apoptotic action varies. In specific, from single mycotoxin treatments on cancer cells STER was highly toxic, as for concentrations ≥ 10-12 Μ reduced MI and PRI and enhanced the relative caspase-3. OTA appeared less cytotoxic by increasing relative caspase-3 from 10-12 Μ without significantly affecting MI and MTT activity. Similar was CTN’s action except for an apoptotic induction at concentrations > 10-8 Μ. Co-administration of STER with OTA and/or CTN showed increased MI and cancer cells metabolic activity as a result of enhanced MTT reduction at concentrations ≥ 10-12 Μ and statistically significant decrease of the relative caspase-3 respectively. Furthermore, due to combination schemes possible mycotoxin interactions were also studied and what was prevalent was an additive or antagonistic interaction for cytotoxic, apoptotic and genotoxic actions in vitro.The study of the mycotoxin’s effect on the anticancer drug showed that STER+SOR and OTA+SOR resulted in significant MI and PRI reduction at concentrations 10-12 – 10-6 Μ, increased SCE ratio for the same concentration range and inhibition of the apoptotic activity at concentrations > 10-8 Μ. Also, it is important to note that SOR co-administration with STER, OTA, CTN exhibited additive and antagonistic interaction profile on apoptotic and cytogenetic actions.Our results for the time indicate that toxic and sub-toxic concentrations (picoMolar) of STER alone or in combination with OTA and/or CTN can be implicated in the induction of cytotoxic and cytogenetic damage in vitro. Additionally, from the under research mycotoxins OTA and STER exerted antagonism on the anticancer drug SOR as a result of apoptotic inhibition and increased cytotoxic and genotoxic potential. Apparently, in vitro exposure on specific toxins is characterized from effects that require further evaluation and consideration in order to illuminate and prevent possible hazardous outcomes on Public Health.

Εθνικοί και διεθνείς Οργανισμοί υπεύθυνοι για την ασφάλεια των τροφίμων επισημαίνουν τις αρνητικές επιπτώσεις στην δημόσια υγεία λόγω μακροχρόνιας έκθεσης σε συγκεκριμένες μυκοτοξίνες και ιδιαίτερα σε συνδυασμούς των ουσιών αυτών. Οι μυκοτοξίνες συνιστούν δευτερογενή προϊόντα μεταβολισμού των μυκήτων που κάτω από ευνοϊκές περιβαλλοντικές συνθήκες ανευρίσκονται σε διάφορα είδη τροφίμων και ζωοτροφών. Σε πρόσφατες μελέτες που αφορούσαν εκτιμήσεις επικινδυνότητας τοξινών που κυριαρχούν στην τροφική αλυσίδα έχει βρεθεί πως συγκεκριμένες μυκοτοξίνες των ειδών Aspergillus και Penicillium spp είναι τοξικές, προκαλούν βλάβες στο κυτταρικό γένωμα και εμπλέκονται σε μηχανισμούς καρκινογένεσης ακόμα και σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις της τάξεως των nanoMolar και picoMolar.Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η αξιολόγηση πιθανών κυτταροτοξικών, αποπτωτικών και γενοτοξικών δράσεων της στεριγματοκυστίνης (STER), της ωχρατοξίνης Α (ΟΤΑ) και της κιτρινίνης (CTN) μεμονωμένα και σε συνδυασμό στην ανθρώπινη ηπατοκαρκινική σειρά Hep3B σε δόσεις από pM έως μM. Ταυτόχρονα, εκτιμήσαμε το πώς επιδρά η συγχορήγηση των υπο μελέτη μυκοτοξινών στην δράση του φαρμάκου SORAFENIB, ενός χημειοθεραπευτικού σκευάσματος πρώτης γραμμής για την αντιμετώπιση προχωρημένων μορφών καρκίνου του ήπατος.Η αναγωγή του ΜΤΤ, η έκφραση της σχετική κασπάση-3, ο μιτωτικός δείκτης (ΜΔ), ο δείκτης ρυθμού πολλαπλασιασμού (ΔΡΠ) και οι χρωματιδιακές ανταλλαγές αδελφών χρωματίδων (ΧΑ, sister chromatid exchanges, SCEs) χρησιμοποιήθηκαν ως δείκτες μεταβολικής δραστηριότητας, απόπτωσης, κυτταροτοξικότητας, κυτταροστατικότητας και γενοτοξικότητας αντίστοιχα.Όλες οι μυκοτοξίνες απλά και σε συνδυασμό οδήγησαν σε στατιστικά σημαντική αύξηση των SCEs για δόσεις ≥ 10-12 Μ και σε στατιστικά σημαντική μείωση του ΔΡΠ για δόσεις ≥ 10-10 Μ. Αντίθετα, η κυτταροτοξική και αποπτωτική τους δράση ποικίλλει. Έτσι λοιπόν, από τις απλές χορηγήσεις μυκοτοξινών στα καρκινικά κύτταρα η STER εμφανίζεται ισχυρά τοξική, καθώς για συγκεντρώσεις ≥ 10-12 Μ μειώνει τον ΜΔ, τον ΔΡΠ και επάγει την σχετική κασπάση-3. Ασθενέστερα κυτταροτοξική εμφανίζεται η ΟΤΑ, που χωρίς να επηρεάζει ιδιαίτερα τον ΜΔ και την αναγωγή του ΜΤΤ αυξάνει την σχετική κασπάση-3 ήδη από τα 10-12 Μ. Ανάλογη είναι και η εικόνα της CTN με την διαφορά ότι επάγει την απόπτωση σε δόσεις > 10-8 Μ. Κατά την συγχορήγηση της STER με OTA ή CTN παρατηρήθηκε ενίσχυση του ΜΔ και της μεταβολικής δραστηριότητας των καρκινικών κυττάρων συνέπεια της αυξημένης αναγωγής του ΜΤΤ, για δόσεις ≥ 10-12 Μ και αντίστοιχη στατιστικά σημαντική μείωση της σχετικής κασπάσης-3. Επιπλέον, λόγω συγχορηγήσεων μελετήθηκαν τυχόν αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μυκοτοξινών και φαίνεται πως παρουσίασαν γενικά μια αθροιστική ή ανταγωνιστική αλληλεπίδραση ως προς τις κυτταροτοξικές, αποπτωτικές και γενοτοξικές τους δράσεις in vitro.Ως προς την επίδραση των υπό μελέτη μυκοτοξινών στο αντικαρκινικό φάρμακο SORAFENIB (SOR) προκύπτει ότι η συγχορήγηση STER + SOR και OTA + SOR οδηγεί σε σημαντική μείωση του ΜΔ και του ΔΡΠ για συγκεντρώσεις από 10-12 – 10-6 Μ, αύξηση των SCEs για το ίδιο εύρος συγκεντρώσεων και αναστολή της αποπτωτικής δράσης σε δόσεις > 10-8 Μ. Επίσης, αξίζει να σημειωθεί πως το SOR σε συνδυασμό με STER, OTA, CTN παρουσιάζει τόσο αθροιστικό όσο και ανταγωνιστικό χαρακτήρα αλληλεπίδρασης σε ότι αφορά αποπτωτικούς και κυτταρογενετικούς μηχανισμούς δράσης.Τα αποτελέσματα μας για πρώτη φορά περιγράφουν ότι τοξικές και υποτοξικές συγκεντρώσεις (picoMolar) STER μεμονωμένα ή και σε συνδυασμό με ΟΤΑ και/ή CTN είναι υπεύθυνες για την πρόκληση κυτταροτοξικών και κυτταρογενετικών βλαβών in vitro. Επιπρόσθετα, από τις υπό μελέτη μυκοτοξίνες η OTA και η STER εμφάνισαν μια ανταγωνιστική τάση ως προς το αντικαρκινικό φάρμακο Sorafenib που είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της απόπτωσης και την επαγωγή κυτταροτοξικών και γενοτοξικών δράσεων. Συνεπώς, η in vitro έκθεση στις συγκεκριμένες τοξίνες χαρακτηρίζεται από δράσεις που χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης και προβληματισμού προκειμένου να διαλευκανθούν και να προληφθούν πιθανές δυσάρεστες επιπτώσεις για την Δημόσια Υγεία.