Διερεύνηση της δράσης της πρωτεϊνικής κινάσης C έψιλον επί της λειτουργικής μνήμης του επίμυ με ποζιτρονική τομογραφία

Abstract

The present study deals with the investigation of the molecular mechanisms involved in the regulation and activation of the important for synaptic plasticity and memory Protein Kinase C epsilon (PKCε) and extracellular signal-regulated kinases ERK1/2 by Cannabinoid Receptors 1 (CB1Rs). The limited resolution and sensitivity of the conventional positron emission tomography (PET) precluded the use of PET in correlating in vivo the cannabinoid-dependent regional metabolic changes with PKCε activity in specific brain areas of rat, such as hippocampus. On the other hand, the study of CB1R proximal signaling in a neuronal cellular context revealed a number of important findings. At first, we presented evidence that the CB1R agonist methanandamide induces a biphasic and sustained activation of ERK1/2 in primary neurons derived from E7 chick embryo telencephalon. We showed that E7 neurons natively express high levels of CB1R message and protein, the majority of which associates with PKCε at basal conditions. We demonstrated that the first peak of ERK activation by CB1R is mediated by the sequential activation of Gq, PLC, and PKCε, selectively, and that the CB1R-activated PKCε acutely forms transient signaling modules containing activated Src and Fyn. A second pool of CB1Rs, coupled to PTX-sensitive activation of Gi/o, utilizes as effectors additional Src and Fyn molecules to generate a second, additional wave of ERK activation at 15 min. Most importantly, further analysis revealed tyrosine phosphorylation and transactivation of fibroblast growth factor receptor (FGFR)1 by CB1R via Src and Fyn, which drives the second amplification wave in ERK1/2 activation. Transactivation of FGFR1 is accompanied by the formation of a protein kinase C ε-dependent multiprotein complex that includes CB1R, Fyn, Src, and FGFR1. Recruitment of molecules increases with time of exposure to methanandamide, suggesting that it also serves trafficking of receptors. Upon agonist stimulation we also detected a rapid incorporation of CB1R, as well as activated Src and Fyn, and FGFR1 in lipid rafts. Most importantly, lipid raft integrity appeared to be a pre-requisite for CB1R-dependent complex formation. Summarizing, when CB1R is concerned, two pathways, namely Gq/PLC/PKCε and Gi/o/Src/RTK, regulate the first and the second amplification of ERK signal, respectively, and lipid rafts organize CB1 receptor proximal signaling events, namely activation of Src and Fyn, and transactivation of FGFR1 towards activation of ERK1/2 and induction of neuronal differentiation. Our data provide the first evidence for multiprotein signaling complex formation in the coupling of CB1R to activation of ERK in CNS neurons, and may elucidate several of the less understood acute effects of cannabinoid drugs.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν οι μηχανισμοί ρύθμισης και τροποποίησης των σημαντικών για τη συναπτική πλαστικότητα και μνήμη PKCε και ERK1/2 από τον CB1 υποδοχέα των κανναβινοειδών στο ΚΝΣ. Η μειωμένη ευαισθησία και χωρική διακριτική ικανότητα της συμβατικής ποζιτρονικής τομογραφίας δεν επέτρεψε το συσχετισμό σε πραγματικό χρόνο των δευτερογενών αλλαγών του μεταβολισμού που προκαλούνται από τα κανναβινοειδή με τη δράση της PKCε στις υπεύθυνες για τη λειτουργική μνήμη εγκεφαλικές περιοχές του επίμυ. Από την άλλη, σε νευρωνικό κυτταρικό περιβάλλον προέκυψε μια σειρά από σημαντικά ευρήματα που αφορούν τους μοριακούς μηχανισμούς μετάδοσης σήματος από τον CB1R. Η ενεργοποίηση του CB1R υποδοχέα με μεθανανδαμίδη αποκάλυψε ενεργοποίηση της ERK σε δύο φάσεις, μία στα 5 λεπτά και μία παρατεταμένη στα 15 λεπτά σε πρωτογενείς νευρώνες φλοιού νεοσσού όρνιθας (Ε7CH). Οι Ε7CH νευρώνες βρέθηκαν να εκφράζουν εξαιρετικά υψηλά επίπεδα CB1Rs, η πλειονότητα των οποίων δείχθηκε για πρώτη φορά να συνδέεται με την PKCε υπό φυσιολογικές συνθήκες. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων μας δείχνουν ότι στην πρώτη φάση ενεργοποίησης της ERK από τον CB1R μεσολαβεί διαδοχική ενεργοποίηση των Gq, PLC και της PKCε, και ότι η ενεργοποιημένη από τον CB1R PKCε αποσυνδέεται από τον υποδοχέα προκειμένου να σχηματίσει παροδικά σύμπλοκα σηματοδότησης με τις ενεργοποιημένες Src και Fyn κινάσες. Μία δεύτερη δεξαμενή CB1Rs συνδέεται με την ενεργοποίηση των Gi/o πρωτεϊνών και χρησιμοποιεί ως τελεστές επιπλέον μόρια Src και Fyn για να επάγει το δεύτερο κύμα της ενεργοποίησης της ERK στα 15 λεπτά. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε διενεργοποίηση του υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών (FGFR) από τον CB1R μέσω των Src και Fyn που βρέθηκε να συνδέεται με τη δεύτερη φάση της ERK ενεργοποίησης. Η διενεργοποίηση του FGFR συνοδεύεται από το σχηματισμό εξαρτώμενων από την PKCε πολυπρωτεϊνικών συμπλόκων που περιλαμβάνουν τον CB1R, τη Fyn, τη Src και τον FGFR. Η στρατολόγηση των μορίων στα σύμπλοκα βρέθηκε να αυξάνεται με το χρόνο έκθεσης στον αγωνιστή, υποδηλώνοντας ότι, επιπλέον της σηματοδότησης, τα συγκροτούμενα σύμπλοκα εξυπηρετούν και την ενδοκυττάρια κυκλοφορία των υποδοχέων. Μετά από ενεργοποίηση με μεθανανδαμίδη ανιχνεύσαμε, επίσης, μια ταχεία επιστράτευση του CB1R, καθώς και των ενεργοποιημένων μορφών της Src και Fyn, και του FGFR στις λιπιδικές σχεδίες, η ακεραιότητα των οποίων αποτελεί προϋπόθεση για το σχηματισμό του συμπλόκου. Τα αποτελέσματά μας μαρτυρούν, συνεπώς, για πρώτη φορά ότι η οδός Gq/PLC/PKCε ρυθμίζει την πρώτη φάση ενεργοποίησης της ERK, ενώ η Gi/o/Src/RTK οδός επάγει τη δεύτερη ενίσχυση της ERK ενεργοποίησης μέσω της οργάνωσης στις λιπιδικές πλατφόρμες των εγγύς γεγονότων σηματοδότησης του CB1R, δηλαδή της ενεργοποίησης της Src και της Fyn, και της διενεργοποίησης του FGFR, οδηγώντας σε νευρωνική διαφοροποίηση.