Λειτουργικές γονιδιωματικές προσεγγίσεις για τη μελέτη της μορφογένεσης στη Drosophila melanogaster

Abstract

In the past years many research groups have focused in the identification ofgenes that are involved in distinct biological processes and Drosophila has providedthe ideal model-organism due to the availability of several genetic tools. Theintroduction of RNAi technology has greatly facilitated the conduction of many largescale genetic analyses in Drosophila. Taking advantage of the available tools weconducted an RNAi-based screen for genes involved in the morphogenesis of thesomatic muscle system and wing epithelium of Drosophila melanogaster.Collectively, we tested 321 genes with either systemic or tissue-specific RNAisilencing in the mesoderm or a combination of both and discovered 58 novel geneswhich are required for proper development and homeostasis of the embryonic/larvalmuscular system. Surprisingly, in almost half of the cases we did not observe a lethalphenotype of complete penetrance arguing that the number of genes involved in theparticular process is greater than the one estimated based on the results of a recentlycompleted genome-wide scale RNAi-based muscle screen. In addition, we tested 242genes by tissue-specific gene inactivation in the epithelia and identified 32 that arerequired for adult viability and 24 that are indispensible for proper adult wingmorphogenesis. Among our positive hits we selected one that is required for bothprocesses for further examination, namely chd64.Chd64 encodes a protein that consists of a calponin-homology (CH) domainand a CLIK23 motif and exhibits 42% and 43% identity with the mammaliantransgelins 2 and 3 respectively. Transgelins comprise a highly conserved family ofproteins that have been implicated in the bundling and stabilization of actin filaments.The Drosophila genome bears three distinct loci: CG4694 or Mp20, CG14996 orChd64 and CG5023 by complete analogy to the mammalian genomes. Our initialresults showed that out of the three genes that code for the fly transgelins only chd64is required for viability and the proper development of muscle and epithelial tissues.In order to gain insight into the function of chd64 it was crucial to: a) explore theexpression pattern of the gene and b) evaluate the effects of chd64 loss of function indiverse tissues. Thus, we generated transgenic flies that bear random insertions of aGFP-tagged genomic fragment for the gene that allowed us to visualize theendogenous gene expression pattern in the living organism throughout development.Meanwhile, we developed an antibody against the full-length Chd64 protein. In addition, we obtained two different UAS:chd64IR strains and many tissue specificGAL4 strains in order to explore the effects of chd64 knock-down in the specifictissues. Finally we generated two deletions that remove chd64. Our data so farindicate that chd64 is largely expressed in the embryonic/larval gut, hemocytes,trachea, nervous system, peritracheal Inka cells, imaginal discs, salivary glands,epidermis and tendon cells. In addition, we observed chd64 expression in the follicleand stalk cells of egg chambers. In all the above mentioned cell types the protein isaccumulated in the cytoplasm and periphery. More detailed analysis using the largesalivary gland cells shows that Chd64 is specifically localized in some membranousstructures of the cytoplasm corresponding to the ER and in the cell cortex where it colocaliseswith actin. Our loss of function studies demonstrate that chd64 expression isindispensable for viability and for the normal morphology and/or function ofmalpighian tubules. We specifically observed that the ablation of chd64 zygoticexpression results in the appearance of bloated tubules and is involved in theabnormal subcellular distribution of DE-cadherin. However the mode of the gene’saction in the above mentioned procedure remains unknown. Consequently, weconclude that chd64 exhibits a complicated expression pattern during developmentand is required for viability. Removal of the maternally derived Chd64 protein andfurther examination of malpighian tubule cell specification and polarity using specificmarkers in wild type and mutant backgrounds will provide a novel insight on thegene’s functions in the whole organism.

Τα τελευταία χρόνια πολλές ερευνητικές ομάδες εστίασαν στην ταυτοποίησηγονιδίων που ενέχονται σε διάφορες βιολογικές διεργασίες και η Δροσόφιλααποτέλεσε τον ιδανικό οργανισμό-μοντέλο λόγω της διαθεσιμότητας πολλώνγενετικών εργαλείων. Η ανάπτυξη της τεχνολογίας της RNA παρεμβολής ευνόησειδιαίτερα την ευρείας κλίμακας γενετική ανάλυση στη Δροσόφιλα. Εκμεταλλευόμενοιτα διαθέσιμα εργαλεία πραγματοποιήσαμε μία μελέτη σάρωσης βασισμένη σε RNAiγια γονίδια που εμπλέκονται στη μορφογένεση του συστήματος των σωματικών μυώνκαι του επιθηλίου του φτερού της Drosophila melanogaster. Συνολικά, εξετάσαμε321 γονίδια με συστημική ή ιστοειδική RNAi σιώπηση στο μεσόδερμα ή μεσυνδυασμό και των δύο και ταυτοποιήσαμε 58 γονίδια άγνωστης λειτουργίας ταοποία χρειάζονται για την ανάπτυξη και ομοιόσταση του εμβρυϊκού/προνυμφικούμυϊκού συστήματος. Περιέργως, στις μισές σχεδόν περιπτώσεις δεν παρατηρήσαμεφαινότυπο θνησιμότητας πλήρους διεισδυτικότητας, γεγονός που υποδεικνύει ότι οαριθμός των γονιδίων που συμμετέχουν στη συγκεκριμένη διεργασία είναιμεγαλύτερος από αυτόν που έχει προβλεφθεί με βάσει τα αποτελέσματα μίας ευρείαςκλίμακας μελέτης σάρωσης με RNAi στο μυϊκό σύστημα που ολοκληρώθηκεπρόσφατα. Επιπλέον, μελετήσαμε 242 γονίδια με ιστοειδική σιώπηση στα επιθήλιακαι ταυτοποιήσαμε 32, τα οποία είναι απαραίτητα για τη βιωσιμότητα, και 24, ταοποία είναι αναγκαία για τη μορφοποίηση του ενήλικου φτερού. Από τα γονίδια πουέδωσαν θετικό αποτέλεσμα επιλέξαμε ένα το οποίο είναι απαραίτητο και για τις δύοδιεργασίες, το chd64.Το chd64 κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη που αποτελείται από μία δομική περιοχήμε ομολογία στις καλπονίνες (CH) και ένα μοτίβο CLIK23 και παρουσιάζει 42% και43% ταυτότητα με τις τρανσγελίνες 2 και 3 των θηλαστικών αντιστοίχως. Οιτρανσγελίνες συνιστούν μία οικογένεια πρωτεϊνών που εμφανίζουν υψηλό βαθμόσυντήρησης και συμμετέχουν στο σχηματισμό δεσμίδων και στη σταθεροποίηση τωνινιδίων ακτίνης. Το γονιδίωμα της Δροσόφιλας εμπεριέχει τρεις διαφορετικούςγενετικούς τόπους: CG4694 ή Mp20, CG14996 ή Chd64 and CG5023, σε πλήρηαναλογία με τα γονιδιώματα των θηλαστικών. Τα προκαταρκτικά αποτελέσματα μαςέδειξαν ότι από τα γονίδια που κωδικοποιούν τις τρεις τρανσγελίνες της Δροσόφιλαςμόνο το Chd64 είναι απαραίτητο για τη βιωσιμότητα και τη σωστή ανάπτυξη τωνμυϊκών και επιθηλιακών ιστών. Για να μελετήσουμε τη λειτουργία του γονιδίου ήταν απαραίτητο: α) να διερευνήσουμε το πρότυπο έκφρασης του και β) να αξιολογήσουμετα αποτελέσματα της απώλειας λειτουργίας του σε διαφορετικούς ιστούς. Έτσι,δημιουργήσαμε διαγονιδιακές μύγες που έφεραν τυχαίες ενθέσεις ενός γενωμικούτμήματος του γονιδίου συζευγμένου με GFP που επέτρεπε την παρατήρηση τουενδογενούς προτύπου έκφρασης του γονιδίου σε ζωντανό οργανισμό κατά τηδιάρκεια της ανάπτυξης. Ταυτόχρονα, δημιουργήσαμε ένα αντίσωμα έναντιολόκληρης της πρωτεΐνης Chd64. Επιπλέον, προμηθευτήκαμε δύο UAS:chd64IRστελέχη και πολλά διαφορετικά GAL4 στελέχη με σκοπό να μελετήσουμε τηνεπίδραση της μειορρύθμισης του chd64 σε διαφορετικούς ιστούς. Τέλος,δημιουργήσαμε δύο ελλείψεις που απομακρύνουν το chd64. Τα δεδομένα που έχουμεως τώρα δείχνουν ότι το chd64 εκφράζεται έντονα στον εμβρυϊκό/προνυμφικόπεπτικό σωλήνα, στα αιμοκύτταρα, στην τραχεία, στο νευρικό σύστημα, σταπεριτραχειακά κύτταρα Inka, στους εμβρυϊκούς δίσκους, στους σιελογόνους αδένες,στην επιδερμίδα και στα τενόντια κύτταρα. Επιπλέον, διαπιστώσαμε έκφραση τουγονιδίου στα θυλακοκύτταρα και μισχοειδή κύτταρα των ωοθυλακίων. Σε όλους τουςπαραπάνω κυτταρικούς τύπους η πρωτεΐνη συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα καιστην περιφέρεια του κυττάρου. Λεπτομερέστερη ανάλυση των μεγάλων κυττάρωντων σιελογόνων αδένων έδειξε ότι η πρωτεΐνη εντοπίζεται σε μεβρανικές δομές πουαντιστοιχούν στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στο φλοιό του κυττάρου, όπουσυνεντοπίζεται με την ακτίνη. Οι μελέτες απώλειας λειτουργίας έδειξαν ότι έκφρασητου chd64 είναι απαραίτητη για τη βιωσιμότητα και τη μορφολογία ή/καιλειτουργικότητα των μαλπιγγιανών σωληναρίων. Συγκεκριμένα, διαπιστώσαμε ότι ηαναστολή της ζυγωτικής έκφρασης του γονιδίου οδηγεί σε διόγκωση τωνμαλπιγγιανών σωληναρίων και σχετίζεται με τη μη φυσιολογική υποκυτταρικήκατανομή της DE-καδερίνης. Ωστόσο, ο τρόπος δράσης του γονιδίου στηνπροαναφερθείσα διαδικασία παραμένει άγνωστος. Η απομάκρυνση της μητρικήςπροέλευσης Chd64 πρωτεΐνης και η εκτενέστερη εξέταση της διαδικασίαςκαθορισμού και της πολικότητας των κυττάρων που συγκροτούν τα μαλπιγγιανάσωληνάρια σε αγρίου τύπου και μεταλλαγμένο γενετικό υπόβαθρο με τη χρήσηκατάλληλων μαρτύρων θα μας δώσουν νέες πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργίατου γονίδιου σε ολόκληρο τον οργανισμό.