Απομόνωση φυσικών παραγώγων με δράση ανασταλτική των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών (CDK’s), σύνθεση αναλόγων τους και μελέτη των βιολογικών ιδιοτήτων τους

Abstract

In this study, the design and synthesis of some new substituted flavopiridol analogues with potential activity against specific protein kinases CDK1 ,CDK5 ή GSK3. For this aim we composed proportionally flavopiridol, in that maintaining their intact rings ([benzo]-γ-[pyron]/ring C) and place 8 (ring D) as for the the flexibility and the lipophilia, therefore we replaced 3-hydroxy [piperidyny] place 8 flavopiridol with [kinouklinidon], N-[methyl]-[tropini] and N-[methyl[-piperid]. This products were checked as for their inhibititor action in vitro in [kinases] CDK1, CDK5 και GSK-3α/β and were evaluated their cytotoxicity in the anticancer lines: DU 145, L1210) HT-29.. Finally, three new synthetic products it was proved that they are stronger inhibitors of also three CDK' s while only product 20 presents inhibition action in concentration (IC50) 5μΜ. that it does not present flavopiridol and can be considered as a new selecty inhibitor of GSK-3[a]/[b], which does not present remarkable cytotoxic action. By the phjytochemical ] study of plants Glycyrrhiza glabra and Glycyrrhiza uralensis were also isolated 62 secondary metabolites from which two are new products and three new natural products. The resulting new molecules are currently undergoing pharmacological evaluation.

Με βάση όλα τα μέχρι στιγμής δεδομένα, φαίνεται ότι η flavopiridol είναι ένας αναστολέας κυκλινοεξαρτώμενων κινασών (CDK’S) και μόλις το 1994 επιβεβαιώθηκε η υπόθεση αυτή αφού βρέθηκε ότι η flavopiridol αναστέλει τη δράση της CDK1 (IC50=0.3μΜ) καταλαμβάνoντας την ίδια περιοχή με αυτή του δακτυλίου της αδενίνης του ATP [καθώς και των CDK2, CDK3 και CDK4. Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει δύο στόχους: 1) την σύνθεση αναλόγων φλαβοπυριδόλης με ισχυρή ανασταλτική δράση στις κινάσες CDK1 ,CDK5 ή GSK3 και αν είναι δυνατόν με κάποιου είδους εκλεκτικότητα μεταξύ των προαναφερθέντων κινασών. Για το σκοπό αυτό συνθέσαμε ανάλογα flavopiridol, στα οποία διατηρώντας άθικτους τους δακτυλίους του φαρμακοφόρου (βενζο-γ-πυρόνη/δακτύλιος C) χαρτογραφήσαμε τον υποκαταστάτη της θέσεως 8 (δακτύλιος D) ως προς τον στερικό όγκο, την ευκαμψία και τη λιποφιλία, οπότε αντικαταστήσαμε την 3-υδροξυ-Ν-μεθυλο πιπεριδυνυλομάδα της θέσεως 8 της flavopiridol με τις ομάδες της κινουκλιδίνης, της Ν-μεθυλο-τροπίνης και της Ν- μεθυλοπιπεριδίνης ώστε να παρατηρήσουμε αν οι τροποποιήσεις αυτές θα προσδώσουν κάποιο είδος εκλεκτικότητας. Τα προϊόντα αυτά ελέγχθηκαν ως προς την ανασταλτική τους δράση in vitro σε κινάσες CDK1, CDK5 και GSK-3α/β και αξιολογήθηκε η κυτταροτοξικοτητάς τους στις καρκινικές σειρές: DU 145, L1210) HT-29. Τελικά, τρία νέα συνθετικά προϊόντα 7, 13, 20 αποδείχθηκε ότι είναι ισχυροί αναστολείς και των τριών CDK’s [CDK1, CDK5, GSK-3α/β], ενώ μόνο το προϊόν 20 εμφανίζει εκλεκτική ανασταλτική δράση σε συγκέντρωση (IC50) 5μΜ έναντι της GSK-3α/β την οποία δεν εμφανίζει η φλαβοπυριδόλη και μπορεί να θεωρηθεί ως ένας νέος εκλεκτικός αναστολέας της GSK-3α/β, ο οποίος δεν εμφανίζει αξιοσημείωτη κυτταροτοξική δράση. 2) την εύρεση νέων φυσικών αναστολέων CDK’s από τα είδη Glycyrrhiza glabra και Glycyrrhiza uralensis (Leguminosae), τα οποία κατά τον προκαταρτικό in vitro έλεγχο βρέθηκαν ότι αναστέλλουν τη δράση των κινασών. Από τη φυτοχημική μελέτη των φυτών Glycyrrhiza glabra και Glycyrrhiza uralensis απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 62 δευτερογενείς μεταβολίτες εκ των οποίων δυο είναι νέα προϊόντα και τρία νέα φυσικά προϊόντα Συνοψίζοντας, λόγω του δεδομένου ότι η γλυκόριζα χρησιμοποιείται ευρέως στη βιομηχανία τροφίμων αναπτύξαμε ένα πρωτόκολλο παραλαβής εμπλουτισμένων κλασμάτων, τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στη βιομηχανία τροφίμων και στη κοσμητολογία 1) Αρχικά υπερκρίσιμη εκχύλιση με CO2 και αιθανόλη (SFE) για την παραλαβή κλασμάτων εμπλουτισμένων με άπολους δευτερογενείς μεταβολίτες: Κλασσική εκχύλιση της δρόγης μετά την υπερκρίσιμη εκχύλιση (με CO2 και αιθανόλη) με αιθανόλη και νερό για την παραλαβή των πολικών δευτερογενών μεταβολιτών και στη συνέχεια i) Επεξεργασία των δυο προαναφερόμενων εκχυλισμάτων, αιθανολικό και υδατικό, με ρητίνη XAD-4, ώστε να παραλάβουμε ένα κλάσμα πλούσιο μόνο σε πολικά φαινολικά παράγωγα και ένα άλλο εμπλουτισμένο με όλα τα σακχαριδικά παράγωγα ii) Το κλάσμα με τα πολικά φαινολικά παράγωγα υποβλήθηκε σε χρωματογραφία κατανομής με φυγοκέντριση (ccc). Όλη η διαδικασία εκτελείται σε υγρές φάσεις χωρίς στερεό υπόστρωμα και λόγω των ήπιων συνθηκών αποφεύγεται η διάσπαση των μεταβολιτών, η οποία λαμβάνει χώρα στις συνηθισμένες χρωματογραφικές τεχνικές. Επιπλέον, με τη τεχνική αυτή είναι δυνατή η 100% ανάκτηση του δείγματος