Φυτοχημική ανάλυση του φαιοφύκους taonia atomaria ( woodward) J. Agardh

Abstract

The PhD thesis describes in detail the procedures, methods and techniques we elaborated in order to achieve a full phytochemical analysis of the organic extract of the Aegean brown alga Taonia atomaria. It also includes the pharmacological evaluation of some of the isolated secondary metabolites. We worked on two separate extracts (29.5g and 180.4g) from two different (chronologically) collections of the organism, both of them from the island of Serifos. The choice to work on two different extracts came from the need to increase the quantities of the isolated metabolites both for receiving more reliable NMR spectra and for having the capability to perform more and more reliable pharmacological tests. The Theoretical Part of the Thesis is a review on the phytochemistry of the Dictyotales - for the first time – including elements of pharmacognosy, chemical ecology and organic synthesis of their isolated metabolites. The Experimental Part A (Chromatographic Part) includes all the chromatographic procedures and techniques we used (GCC, VCC, HPLC) for the separations and the final purifications of the metabolites. Before we proceed to the Chromatographic Part we introduce the whole combined network of the HPLC ‘s in seven charts including details like the nature of the stationary phases, the solvent systems, the codification of the peaks and their poolings. The Experimental Part B contains the Structure Elucidation of the isolated metabolites including the worked NMR spectra (one and two dimensional), and the MS spectra as well as the detailed analysis we performed in order to define the fine structure of the molecules (relative stereochemistry). The Experimental Part C contains the pharmacological evaluation of some of the isolated metabolites including the anti-oxidant, anti-inflammatory, cytostatic and the anti-fouling activity. We isolated 48 secondary metabolites all of them (except for the Metabolites 39, 40, 41, 42 and 43) belonging to the chemical family of Meroditerpenoids. The isolated Meroditerpenoids can be further distinguished into 4 different subfamilies. The first one (LmD, Linear mero-Diterpenoids) includes the Metabolites 1-22, which are all derivatives of saragaquinone (Metabolite 1) or sargaquinole (Sty.7, Theoretical Part, a metabolite that we didn’t isolate from T. atomaria), with modifications on the prenyl-chain or/and on the benzoquinonic or hydroquinolic ring (geometrical isomerization always on the first prenyl-group, hydroxylations / acetylations / methoxylations on the prenyl-chain, fatty-acid acetylations of the phenyl-hydroxyl-group of the aromatic ring. Eighteen of these metabolites are new chemical structures (Metabolites 2-8, 10, 11 13-22) while two of them are new natural products (Metabolites 9, 12). Several of these linear metabolites were isolated as inseparable mixtures of 2Z/2E isomers with the 2Z isomer being in all cases the minor constituent (Metabolites 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 13/14, 15/16, 18/19) but we managed to elucidate their structures and to make the chemical assignments (in all cases for the major 2E). X The second sub-family (CmD) contains five chromenol/chromanol meroditerpenoids (Metabolites 23-27), two of which are new chemical structures (Metabolites 24 and 25). The third sub-family (ACmD) includes the cyclised meroditerpenoids which in turn is divided into three further categories, depending on the way the aromatic-part of the molecule is connected to the prenyl-part. The first category (ACmD-I) includes the benzopyranic cyclised meroditerpenoids, that is the molecules that contain a benzopyranic ring for connecting the two parts of it. We isolated 5 metabolites of this category (Metabolites 28-32), two of them being new chemical structures. The second category (ACmD-II) includes the benzofuranic cyclised meroditerpenoids which contain a benzofuranic ring for connecting the aromatic and the prenyl-parts of the molecules. ..

H Διατριβή αυτή περιγράφει την διαδικασία που ακολουθήσαμε, τις μεθόδους και τις τεχνικές που χρησιμοποιήσαμε για να ολοκληρώσουμε την πλήρη φυτοχημική ανάλυση του φαιοφύκους Taonia atomaria του Αιγαίου, καθώς επίσης και την φαρμακολογική αξιολόγηση μερικών από τους μεταβολίτες που απομονώσαμε. Επεξεργαστήκαμε δύο οργανικά εκχυλίσματα (CH2Cl2/MeOH, 1/3 v/v) του οργανισμού, και τα δύο από συλλογές από την θαλάσσια περιοχή της Σερίφου, το πρώτο με μάζα 29.5g και το δεύτερο με μάζα 180.4g. Ta δύο εκχυλίσματα δουλεύτηκαν σχεδόν παράλληλα για να αυξήσουμε τις ποσότητες των απομονωμένων δευτερογενών μεταβολιτών, αφ’ενός για να παραλάβουμε περισσότερο αξιόπιστα φάσματα NMR αφ’ετέρου για να διαθέσουμε σημαντικότερες ποσότητες για την φαρμακολογική αξιολόγησή τους. Η χρωματογραφική πορεία απομόνωσης των μεταβολιτών περιελάμβανε στα πρώτα στάδια, χρωματογραφίες στήλης υπό κενό (VCC) και χρωματογραφίες στήλης βαρύτητας (GCC), το διαχωριστικό αποτέλεσμα των οποίων παρακολουθούνταν από αναλυτικές χρωματογραφίες λεπτής στοιβάδας (ΤLC) και φασματοσκοπία 1HNMR. Κάποια κλάσματα από τις παραπάνω πορείες (αυτά που περιείχαν το χλωροφυλλούχο φορτίο του φύκους) διαχωρίστηκαν με παρασκευαστικές χρωματογραφίες λεπτής στοιβάδας (PΤLC), ενώ το τελικό στάδιο διαχωρισμού και καθαρισμού των μεταβολιτών επιτεύχθηκε με μια μεγάλη σειρά από συνδυασμένες υγρές χρωματογραφίες υψηλής πίεσης (HPLC) κανονικής και αντίστροφης φάσης. Όλη η πορεία απομόνωσης περιγράφεται με διαγραμματικές παραστάσεις, πριν το Χρωματογραφικό Μέρος της εργασίας και περιλαμβάνει κάποιες λεπτομέρειες που αφορούν το είδος του πληρωτικού υλικού της στήλης, τα συστήματα διαλυτών που χρησιμοποιήθηκαν, τους αριθμούς κορυφών και τις συννενώσεις τους, καθώς και τους κωδικούς που χρησιμοποιήθηκαν για τις καθαρές ουσίες. Στο ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ της εργασίας έχουμε προχωρήσει σε μια πλήρη ανασκόπηση της Φυτοχημείας των Dictyotales - μελέτη που δεν υπάρχει στη βιβλιο- γραφία - η οποία περιέχει και στοιχεία Φαρμακογνωσίας, Χημικής Οικολογίας και Σύνθεσης των μεταβολιτών τους. Το Χρωματογραφικό Τμήμα (Α ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ) περιλαμβάνει όλες τις χρωματογραφικές πορείες (GLC, VLC, HPLC) που οδήγησαν στην τελική απομόνωση των μεταβολιτών. Το Β ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ (Φασματοσκοπικό Τμήμα) περιλαμβάνει την φασμα- τοσκοπική ανάλυση καθενός από τους απομονωμένους μεταβολίτες χωριστά καθώς και την πορεία που ακολουθήσαμε για να καταλήξουμε στις προτάσεις μας για τις τελικές δομές τους (σχετικές στερεοχημείες). Επίσης περιλαμβάνει όλα τα φάσματα εργασίας NMR μιάς και δύο διαστάσεων καθώς και φάσματα MS. Το Γ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ περιλαμβάνει την φαρμακολογική αξιολόγηση των απομονωμένων μεταβολιτών (αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη, κυτταροστατική και αντι-βιοεπίστρωσης). Απομονώσαμε 48 δευτερογενείς μεταβολίτες από την Taonia atomaria (Πίνακες Ι και ΙΙ) οι οποίοι ανήκουν όλοι (εκτός των Μεταβολιτών 39, 40, 41, 42 και 43) στην χημική οικογένεια των μεροδιτερπενίων (meroditerpenes). Τα μεροδιτερπένια περιλαμβάνονται στους μεταβολίτες μικτής βιοσύνθεσης (μεροτερπένια), μόρια δηλαδή που αποτελούνται από δύο τμήματα που προέρχονται το καθένα από δύο διαφορετικά βιοσυνθετικά μονοπάτια. Το πρώτο μέρος είναι αρωματικό και το δεύτερο αλειφατικό. V Το αρωματικό τμήμα είναι πάντα ένας παρα-βενζοκινονικός ή παρα-υδροκινονικός δακτύλιος που προέρχεται βιοσυνθετικά από το ΄΄δρόμο΄΄ του σικιμικού οξέος και το αλειφατικό τμήμα είναι τερπενικό και προέρχεται βιοσυνθετικά από το ΄΄δρόμο΄΄ του μεβαλονικού οξέος (Σχήματα 8α,b). Στα μεροδιτερπένια ειδικά, το τερπενικό κομμάτι αποτελείται από 20 άτομα C , είναι δηλαδή διτερπένιο...