Σχεδιασμός, ανάπτυξη και φαρμακολογική αξιολόγηση νέων παραγώγων ιντιρουμπίνης

Abstract

Indigoids constitute a group of molecules that consist of indigo and its isomeric derivatives. Their chemical structure derives from the dimerization of two indolic compounds. They can be either isolated from natural sources, such as plants, mollusks, mammals or bacteries, or chemically synthesized. Indirubin derivatives (2’-3 connection of the two indolic rings), collectively referred to as indirubins, have shown a large number of pharmacological actions. The most important ones are anticancer, antiviral, antiparasitic and anti-inflammatory activity and neuroprotection. Derivatives of isoindigo (3’-3 connection of the two indolic rings) have also shown an important cytotoxic effect. Indirubins are potent pharmacological inhibitors of kinases. The most important and the most studied ones are cyclin-dependent kinases (CDKs) and glycogen synthase kinase-3 (GSK-3). Recently, it has been reported that certain indirubins inhibit Stat3 signaling. Some of them are also potent ligands of the dioxin receptor (AhR). The aforementioned molecular targets participate in the regulation of the cell cycle, but also in many other signaling pathways. Therefore, they are involved in many pathological situations where deregulation of these pathways is involved. Consequently, indirubins have been proven to be a valiable tool for the study of the cellular functions. At the same time, they constitute a very promising category of drug candidates. The biggest problem to be solved before their application in therapeutics is poor solubility and bioavailability. The assessement of all the information described before led to the principal aim of this phD thesis, which consisted of the synthesis of new derivatives bearing better pharmacological and pharmacokinetic properties. In summary, 113 new indirubin and isoindigo derivatives have been synthesized. Firstly, 3’ substitution of indirubin, 5-bromoindirubin and 7-bromoindirubin with hydrophilic groups was evaluated. It was demonstrated that this kind of substitution enhances in some cases the activity whether it concerns the inhibitory activity against kinases (derivatives of indirubin and 5-bromoindirubin) whether it concerns the cytotoxic activity of 7-bromoindirubin derivatives. Furthermore, 4’, 5’ and 6’ substituted derivatives of indirubin, 6-chloroindirubin, 6-bromoindirubin and 7-bromoindirubin were prepared. The first results concerning the inhibitory kinase activity of 6-substituted derivatives showed that 5’ substitution is the most suitable one. Their biological activities are still under investigation. In addition to the above, a whole new scaffold, 7-azaindirubin, and its derivatives have been synthesized. The interest of these compounds focuses in their cytotoxic activity (7-substituted indirubins don’t inhibit CDKs and GSK-3) which is not yet fully evaluated. A derivative of azaisoindigo was also synthesized and it showed no pharmacological interest. In order to explore the mechanism of action of 7-substituted indirubins and recognize their molecular targets, several compounds where substituted with long polyetheric aminic chains. The affinity chromatography of these derivatives is an undergoing procedure and results are not yet fully acquired. Finally, the metabolism in vitro of 6BIO and 7BIO was investigated and it was demonstrated that these are stable molecules which are almost uniquely metabolized in the corresponding glucuronides.

Τα ιντιγκοειδή είναι μία κατηγορία ενώσεων, που συμπεριλαμβάνει το ίντιγκο και ισομερή με αυτό μόρια. Πρόκειται για διμερή παράγωγα του ινδολίου, τα οποία είτε απομονώνονται από φυσικές πηγές (φυτά, γαστερόποδα μαλάκια, θηλαστικά και βακτήρια), είτε προκύπτουν από χημική σύνθεση. Στην κατηγορία των ιντιγκοειδών ανήκουν και τα παράγωγα ιντιρουμπίνης (2’-3 σύνδεση των ινδολικών δακτυλίων), τα οποία αναφέρονται συλλογικά ως ιντιρουμπίνες και τα οποία έχουν επιδείξει ένα πλήθος φαρμακολογικών δράσεων, όπως είναι η αντικαρκινική, η νευροπροστατευτική, η αντιϊκή, η αντιπαρασιτική, η αντιφλεγμονώδης κ.α. Εκτός από τις ιντιρουμπίνες, σημαντική κυτταροτοξικότητα έχουν επιδείξει και παράγωγα του ισοΐντιγκο (3’-3 σύνδεση των ινδολικών δακτυλίων). Οι ιντιρουμπίνες ανήκουν στην κατηγορία των φαρμοκολογικών αναστολέων πρωτεϊνικών κινασών. Οι κυριότεροι μοριακοί στόχοι τους, οι οποίοι έχουν μελετηθεί εκτεταμένα μέχρι σήμερα, είναι οι κυκλινοεξαρτώμενες κινάσες (CDKs) και η συνθάση του γλυκογόνου (GSK-3). Εκτός από αυτές, παράγωγα ιντιρουμπινών αναστέλλουν και τη βιοχημική οδό του Stat3, αποτελούν ισχυρούς συνδέτες του υποδοχέα της διοξίνης (AhR) κ.α. Οι μοριακοί στόχοι των ιντιρουμπινών συμμετέχουν στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, αλλά και σε άλλες βιοχημικές οδούς, με αποτέλεσμα να εμπλέκονται σε πολλές παθολογικές καταστάσεις, όπου παρατηρείται απορρύθμιση των οδών αυτών. Το γεγονός αυτό τις καθιστά πολύτιμα μόρια τόσο για τη διερεύνηση των κυτταρικών λειτουργιών όσο και για την ανακάλυψη νέων φαρμάκων. Το μεγαλύτερο πρόβλημα, όμως, που έχει προκύψει κατά τη μελέτη τους είναι η μειωμένη διαλυτότητα που συνεπάγεται και μειωμένη βιοδιαθεσιμότητα. Με βάση τα παραπάνω, στην παρούσα διδακτορική διατριβή συντέθηκαν 113 νέα παράγωγα ιντιρουμπίνης και ισοΐντιγκο, με στόχο τόσο τη διερεύνηση της σχέσης δομής-δράσης όσο και τη βελτίωση της υδατοδιαλυτότητας. Πιο συγκεκριμένα, κατ’αρχάς, παρασκευάστηκαν παράγωγα της ιντιρουμπίνης, της 5-βρωμοϊντιρουμπίνης και τις 7-βρωμοϊντιρουμπίνης με υδρόφιλες υποκαταστάσεις στη θέση 3’ και διαπιστώθηκε ότι η υποκατάσταση στη θέση αυτή μπορεί να βελτιώσει τόσο τη διαλυτότητα όσο και τη δραστικότητα, είτε αυτή αφορά την ανασταλτική δράση στις κινάσες (δύο πρώτες κατηγορίες) είτε αφορά την κυτταροτοξικότητα (παράγωγα 7-βρωμοϊντιρουμπίνης). Παρασκευάστηκαν, επίσης, και παράγωγα της ιντιρουμπίνης, της 6-χλωροϊντιρουμπίνης, της 6-βρωμοϊντιρουμπίνης και της 7-βρωμοϊντιρουμπίνης με υποκαταστάσεις στις θέσεις 4’, 5’ και 6’, η φαρμακολογική αξιολόγηση των οποίων βρίσκεται υπό εξέλιξη. Από τα αποτελέσματα που έχουν προκύψει μέχρι σήμερα για τα 6-υποκατεστημένα παράγωγα, φαίνεται ότι η 5’-υποκατάσταση είναι η καταλληλότερη για διατήρηση ή ενίσχυση της ανασταλτικής δράσης στις κινάσες και αύξηση της διαλυτότητας. Ταυτόχρονα, συντέθηκε και ένας νέος σκελετός, αυτός της 7-αζαϊντιρουμπίνης, και διάφορα παράγωγα του. Το ενδιαφέρον των παραγώγων αυτών εστιάστηκε στην κυτταροτοξική τους δράση (τα 7-υποκατεστημένα παράγωγα ιντιρουμπίνης δεν αποτελούν αναστολείς των CDKs και της GSK-3), η οποία δεν έχει ακόμη διερευνηθεί πλήρως. Συντέθηκε παράλληλα και ένα παράγωγο του αζαϊσοΐντιγκο, το οποίο δεν παρουσίασε φαρμακολογικό ενδιαφέρον. Εκτός από τα παραπάνω, παρασκευάστηκε και μία σειρά προϊόντων με υποκατάσταση με μεγάλου μήκους πολυαιθερικές αμινοτελικές αλυσίδες, ώστε να διερευνηθεί ο μηχανισμός της κυτταροτοξικότητας των 7-υποκατεστημένων παραγώγων, μέσω χρωματογραφίας συγγένειας, η οποία βρίσκεται επίσης υπό εξέλιξη. Τέλος, διερευνήθηκε και ο μεταβολισμός in vitro της 6ΒΙΟ και της 7ΒΙΟ, οπότε και διαπιστώθηκε ότι πρόκειται για αρκετά σταθερά μόρια, τα οποία μεταβολίζονται κυρίως σε γλυκουρονίδια.